Protease Inhibitor Cocktail_用于真菌和酵母提取物,增加蛋白稳定性_DateSheet

MCE抑制剂Cocktail家族全系列产品，为您的蛋白质检测保驾护航！“曾经，有一批待检蛋白摆在我的面前，我没有及时检测，等到它降解了，我才后悔莫及。

实验中最痛苦的事莫过于此……只能，再提一批！”实验室的故事，说多了都是泪啊。

尤其蛋白质的研究，一不小心样品就降解了、去乙酰化了，检测结果必然一无所获。

还好有MCE inhibitor cocktail家族为您的蛋白质提供全方位的保护。

蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、去乙酰化酶抑制剂……不管您的课题是细胞通路、肿瘤研究、蛋白组学研究、免疫研究等，总有一款适合您！快点击以下产品链接，申请免费试用吧！MCE抑制剂产品介绍HY-K0010Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO)用于细胞裂解与组织抽提。

HY-K0011Protease Inhibitor Cocktail, mini-Tablet (EDTA-Free)用于细胞裂解与组织抽提，片剂更便于使用。

HY-K0021Phosphatase Inhibitor Cocktail I (100X in DMSO)有效抑制碱性、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。

HY-K0022Phosphatase Inhibitor Cocktail II (100X in ddH2O)有效抑制酸性、碱性、酪氨酸磷酸酶。

HY-K0023Phosphatase Inhibitor Cocktail III (100X in DMSO)有效抑制碱性、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。

HY-K0030Deacetylase Inhibitor Cocktail (100X in 70% DMSO)有效抑制蛋白的去乙酰化作用。

*试用装详情请咨询销售。

三、凝胶滞留试验(EMSA)凝胶迁移滞留试验(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法,目前已经成为转录因子研究的经典方法,并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合,电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢,即表现为相对滞后。

(一)转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以GST标签为例。

裂解液:25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM NaEDTA、1mM DTT和21×Complete Protease InhibitorCocktail。

洗脱液:50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%(v/v)Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。

EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液:25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na2Protease InhibitorCocktail。

1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。

2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中,37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。

3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM,28℃、200 rpm培养6 h。

4 冰上放置10 min,4℃、3000×g离心15 min,收集菌体并称重。

5 每克菌体加入3 mL裂解液,重悬菌体,加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1,在冰上温和地搅动菌液30 min。

6 超声波破碎30 s(破碎10 s停10 s)。

引用文献1. M.R. Plewes, P.D. Burns. "Effect of fish oil on agonist-induced receptor internalization of the prostaglandin F 2α receptor and cell signaling in bovine luteal cells in vitro." Domestic Animal Endocrinology. 2017 December 122. Rana PS, Mudrak NJ, et al. "Phase separation in necrotic cells." Biochem Biophys Res Commun. 2017 Oct 21;492(3):300-303.相关生物数据相关生物数据产品描述在平衡状态下内源性蛋白质产生并降解，因此在稳定的环境条件下其细胞水平是稳定的。

粗细胞提取物含有许多能够降解提取物中的蛋白质的内源酶，例如磷 酸酶和蛋白酶。

当在体外从细胞和组织中提取蛋白质时，蛋白质产生被显著抑制，降解增加。

提高完整蛋白质产量的最佳方法是加入已知存在的那些酶的抑制剂。

蛋白酶抑制剂cocktail 用于细胞裂解物或组织提取物以提高蛋白质的稳定性。

该cocktail 起到抑制蛋白酶的作用，这种蛋白酶会降解非磷酸化或磷酸化蛋白质底物。

该蛋白酶抑制剂cocktail 包含单个组分，包括对半胱氨酸，丝氨酸，酸性蛋白酶和氨基肽酶具有广泛特异性的 AEBSF ，Aprotinin ，Bestatin ，E-64，Leupeptin 和 Pepstatin A 。

已经用哺乳动物细胞和组织提取物对这种蛋白酶抑制剂cocktail 进行了优化和测试。

该蛋白酶抑制剂cocktail 作为DMSO 即用溶液提供。

实验操作在室温下解冻，然后在实验前以1:100（v / v ）稀释至溶液样品（如细胞裂解物或组织提取物）。

蛋白酶及其抑制剂
一、蛋白酶－抑制剂对照表
二、蛋白酶抑制剂混合物选择表
三、抑制剂－蛋白酶对照表
想要寻找适合您的蛋白酶抑制剂？请参看以下蛋白酶－抑制剂对照表！
为了您实验方便，我们向您提供以下蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合物表一、蛋白酶抑制剂混合物
表二、蛋白酶抑制剂（按蛋白酶抑制剂名称英文字母排序）：
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蛋白体外结合实验联合质谱分析鉴定Num1的互作蛋白唐仙英;肖瑶;海力【摘要】目的:为了解析芽殖酵母Num1蛋白在纺锤体定位和线粒体中的调节机制.方法:利用大肠杆菌原核表达并纯化了在Num1功能中起核心作用的补丁组装(PA)结构域的重组蛋白,通过蛋白体外结合实验(Pull-down)分离了酵母细胞中与PA结构域相结合的蛋白复合物,并对其进行了质谱分析.结果:鉴定了一系列新的Num1互作蛋白,包括核糖体蛋白,参与蛋白折叠、分配及转运的内质网和高尔基复合体蛋白,参与基因转录和翻译的核酸酶和蛋白酶,及其他功能的蛋白.结论:Num1的互作蛋白的鉴定为进一步研究Num1的作用机制奠定了基础.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(037)004【总页数】4页(P27-30)【关键词】芽殖酵母;动力蛋白;PA结构域;纺锤体定位【作者】唐仙英;肖瑶;海力【作者单位】中南民族大学生命科学学院,武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室,武汉430074;中南民族大学生命科学学院,武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室,武汉430074;中南民族大学生命科学学院,武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】Q26为确保细胞的命运决定因子准确地分配到每个子细胞，所有真核细胞均须正确定位有丝分裂纺锤体[1].细胞质动力蛋白Dynein在各类细胞的纺锤体定位过程中起关键作用[2-4].在芽殖酵母的不对称分裂过程中，为了能沿胞质微管产生拉力移动纺锤体，Dynein在与微管相连的同时，需被锚定在细胞膜上.Dynein在细胞膜上的锚定依赖于Num1(Nuclear migration 1，核迁移1)[5-7]，Num1是迄今为止所发现的参与纺锤体定位的唯一位于细胞膜上的因子.Num1蛋白大约313 kDa，由多个结构域组成.其中，位于其C末端的PH结构域通过与细胞膜上的磷酸肌醇PI(4,5)P2相互作用介导Num1与细胞膜结合[8,9]；而另一个位于其N末端含有两段预测的Coiled-coil序列的结构域则通过自我相互作用介导Num1在细胞膜上形成由14个分子组成的补丁状复合物，因此被命名为Patch Assembly(PA)结构域[10].此外，PA结构域也介导Num1与Dynein的相互作用[10].定位于细胞膜上的Num1复合物不具有运动性[8, 11]，除了在纺锤体定位中的作用，它还通过与线粒体膜上特定种类的脂类物质结合而介导线粒体与细胞膜的连接，并由此调节线粒体的分裂[12，13].Lackner 等[10, 12]发现线粒体与细胞膜的连接是由Num1的PA结构域尤其是其中预测的Coiled-coil序列所介导，但Num1在纺锤体定位与线粒体中的活性如何调节目前尚不清楚.本研究利用在BL21大肠杆菌细胞中表达纯化的PA结构域，通过Pull-down实验分离酵母细胞中与PA结构域相互作用的蛋白质，并进一步通过质谱分析完成鉴定，旨在通过鉴定Num1的互作蛋白，为揭示Num1的作用途径及机制奠定基础.1 材料与方法1.1 材料和仪器DH5α和BL21大肠杆菌细胞(北京鼎国昌盛)；蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktail, Roche)，S蛋白琼脂糖(S protein agarose slurry)、Bugbuster蛋白提取反应液(Novagen)；氨苄青霉素、氯霉素、异丙基硫代半乳糖苷IPTG、苯甲基磺酰氟PMSF(BioSharp).高速冷冻离心机(CR22G型, HITACHI)；微量冷冻离心机(FC5515R型, OHAUS)；高压细胞破碎仪(BT40/TS2/AA型, Constant System Cell Disruptor)；凝胶成像分析仪(Universal Hood II型, BIO-RAD).1.2 质粒与酵母菌株编码Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z的质粒pXT65(PCN: PreScission蛋白酶酶切位点，S: S-tag, TEV: TEV蛋白酶酶切位点，Z: IgG binding motif)用于表达PA结构域与S-tag的融合蛋白，其构建方法如下：编码Num1 1-303 aa且在5′端含有一个Nco I限制性内切酶位点，3′端含有一个Not I限制性内切酶位点的DNA片段分别用正向引物5′-CCAGCCATGGCCTCCCACAACAACAGGCATAAAAAG-3′和反向引物5′-CCAGGCGGCCGCCAGATGTTACTGTAGTATCG-3′从酵母基因组DNA通过PCR 扩增，扩增的片段经Nco I和Not I酶切后与同样经Nco I和Not I酶切的载体pBSG01[10]连接并经测序确认，产生pXT65.pXT66(PCN-S-TEV-Z)为空载体对照.酵母菌株YWL555[10].基因型为MATα num1Δ∷HIS3 ura3-52 lys2-801 leu2-Δ1 his3-Δ200 trp1-Δ63.1.3 大肠杆菌细胞培养质粒制备或转化用DH5α细胞，重组蛋白表达和制备用BL21细胞[14].DH5α细胞用含氨苄青霉素的LB培养基于37 ℃培养.用于制备重组蛋白的BL21细胞按下述方式培养：保存于-80 ℃的BL21大肠杆菌细胞在含氨苄青霉素的LB固体培养基上37 ℃过夜培养.次日从LB平板上挑取细胞接种到含氨苄青霉素和氯霉素的LB 液体培养基，37 ℃过夜培养.第3 d将液体培养基中的细胞稀释至OD600=0.1，25 ℃培养3 h，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5 mmol/L，20 ℃培养16 h诱导融合蛋白表达，离心收集细胞.1.4 蛋白可溶性检测按1.2培养的BL21细胞经离心收集后，按每0.01 g细胞加入50 μL Bugbuster 蛋白提取反应液，混匀，室温下轻摇15 min，4 ℃ 16000 g 离心20 min；分别取上清和沉淀加入蛋白上样缓冲液，沸水煮5 min.将上清和沉淀制备的蛋白样品分别经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后用考马斯亮兰染色，比较目的蛋白在上清和沉淀中的分配比例.1.5 Pull-down实验1.5.1 重组蛋白的制备携带pXT65和pXT66的BL21大肠杆菌按1.3各收集5 g细胞.按照每克细胞1 mL的比例加入Bind/Wash buffer [150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5), 0.05% TritonX-100, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, Protease Inhibitor Cocktail]，用高压细胞破碎仪(压力207 MPa, 4 ℃)破碎细胞.破碎的细胞4 ℃下12000 g 离心10 min，收集上清，此为大肠杆菌细胞裂解液.取100 μL S protein agrose悬液，1000 g离心1 min，除去上清，用Bind/Wash buffer洗3次，每次1 mL.加入大肠杆菌细胞裂解液，4 ℃旋转混合45 min，离心，除去上清.再用Bind/Wash buffer洗珠子3次，每次5 mL，洗过的珠子置于冰上. 1.5.2 酵母细胞裂解液的制备离心收集YPD液体培养基中旺盛生长的对数期YWL555细胞，每个pull-down 实验需要5 g湿细胞. 按1 mL/g的比例加入酵母裂解缓冲液[30 mmol/L HEPES (pH 7.4), 50 mmol/L乙酸钾, 2 mmol/L醋酸镁, 0.2 mmol/L EGTA, 0.05% Triton X-100, 1 mmol/L DTT, Protease Inhibitor Cocktail (Roche)]，用高压细胞破碎仪破碎细胞.破碎的细胞液10000 g离心5 min，上清即为酵母细胞裂解液.1.5.3 Pull-down反应将1.5.2中制备的酵母细胞裂解液加入到1.5.1中已结合了重组蛋白的S蛋白琼脂糖中，4 ℃旋转2 h，1000 g离心1 min，移去上清.用Wash buffer [10mmol/L Tris-Cl (pH 8.0), 150 mmol/L KCl, 10% Glycerol, 0.05% Triton X-100, 1 mmol/L DTT, Protease Inhibitor Cocktail (Roche)] 洗3次，每次8 mL，除去Wash buffer，加入100 μL 蛋白上样缓冲液，沸水煮5 min，收集上清保存于-20℃.1.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白鉴定所有的蛋白质样品均用10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测[15].其中Pull-down沉淀下来的酵母蛋白样品10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，再用考马斯亮蓝染色液染色，切下被PA结构域融合蛋白沉淀下来的特异性蛋白条带进行鸟枪法(shotgun)LC-MS质谱分析.2 结果与分析2.1 PA结构域重组蛋白的表达PA结构域是预测的Coiled-coil结构，高度不可溶.比较了不同培养条件下Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z融合蛋白在BL21大肠杆菌中的表达(见图1)，最后确定适宜的诱导条件为IPTG浓度0.5 mmol/L，20 ℃过夜培养，此时Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z存在于细胞裂解液上清的比例相对较高，图1中虚线框对应预期蛋白带，箭头指示为该蛋白在20 ℃条件下表达(图1b)较37 ℃下表达(图1a)时存在于裂解液上清中的比例高.1,3,5,7)上清；2,4,6,8) 沉淀a) 37 ℃, IPTG 0.5 mmol/L; b) 20 ℃, IPTG 0.5 mmol/L图1 不同条件下蛋白诱导表达结果Fig.1 Protein expression induced under different conditions2.2 PA结构域重组蛋白的纯化携带pXT65[Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z]或pXT66(PCN-S-TEV-Z)的BL21大肠杆菌细胞在含0.5 mmol/L IPTG浓度的培养基中20 ℃过夜培养诱导蛋白表达.由于诱导表达的Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白含有一个S-tag，因此可在裂解大肠杆菌细胞后，使其与S蛋白琼脂糖珠子结合而得到纯化，结果见图2.如图2所示：S蛋白琼脂糖能从表达pXT65的大肠杆菌细胞裂解液中沉淀下来Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白(箭头所示)，而未从表达空载体pXT66的大肠杆菌细胞裂解液中沉淀下来蛋白.图2 Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白的纯化Fig.2 Purification ofNum1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z protein2.3 PA结构域重组蛋白与酵母蛋白的离体结合为分离与PA结构域相互作用的酵母蛋白，用结合在S蛋白琼脂糖珠子上的Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白与酵母细胞裂解液进行了离体结合实验，即Pull-down实验.由于PA结构域具有自我相互结合的特性[10]，为防止PA结构域与酵母内源的Num1蛋白相结合，酵母细胞裂解液从已敲除了野生型NUM1基因的酵母菌株(num1Δ，即YWL555)中制备.洗去非特异性结合的蛋白质，即获得了结合在S蛋白琼脂糖珠子上的Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z及与其结合的其他蛋白质的复合物.此蛋白复合物样品经SDS-PAGE分离后用考马斯亮蓝染色，结果见图3.如图3所示：上箭头为Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白，下箭头是被Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z特异性沉淀下来的蛋白复合物(即pXT66的Pull-down样品中缺乏的蛋白)，将其切割下来进行质谱分析，用于鉴定与PA 结构域互作的蛋白.图3 Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z的Pull-down蛋白检测Fig.3 Detection of proteins pulled down by Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z 2.4 互作蛋白的鉴定通过对Pull-down沉淀下来的蛋白复合物进行鸟枪法(shotgun)LC-MS质谱分析，鉴定出一系列新的与Num1相互作用的蛋白，按照参与的细胞功能分组如表1.3 结语位于Num1 N末端的PA结构域(1-303 aa)在Num1的功能中起核心作用，缺失了PA结构域的Num1将同时失去其在纺锤体定位和线粒体中的功能[10,12,13].为分离Num1的互作蛋白，在大肠杆菌细胞中表达了PA结构域和纯化标签的融合蛋白Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z，并用S protein agarose对其进行了纯化.结合在S protein agarose珠子上的重组蛋白用于从不表达内源Num1蛋白的酵母细胞裂解液中沉淀PA结构域的互作蛋白.通过对沉淀下来的蛋白进行鸟枪法LC-MS质谱分析，鉴定了一系列新的Num1的互作蛋白，包括大量的核糖体蛋白和参与蛋白折叠转运的蛋白，参与基因转录和翻译的核酸酶和蛋白酶，及其他功能各异的蛋白质.这些结果为进一步揭示Num1在纺锤体定位及线粒体中的作用机制奠定了基础，也为此过程的调控机制提供了更多思路.表1 Num1的互作蛋白Tab.1 Proteins interacting with Num1参考文献【相关文献】[1] Torres E M, Williams B R, Amon A. Aneuploidy: cells losing their balance[J].Genetics, 2008, 179(2): 737-746.[2] Nguyen-Ngoc T, Afshar K, Gönczy P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans [J]. Nat Cell Bio, 2007, 9(11): 1294-1302.[3] Siller K H, Cabernard C, Doe C Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts [J]. Nat Cell Biol, 2006, 8(6): 594-600.[4] Du Q, Macara I G. Mammalian Pins is a conformational switch that links NuMA to heterotrimeric G proteins [J]. Cell, 2004, 119(4): 503-516.[5] Bloom K. Nuclear migration: cortical anchors for cytoplasmic dynein [J]. Curr Biol, 2001, 11(8): 326-329.[6] Farkasovsky M, Kuntzel H. Cortical Num1 interacts with the dynein intermediate chain Pac11p and cytoplasmic microtubules in budding yeast [J]. J Cell Biol, 2001, 152(2): 251-262.[7] Markus S M, Punch J J, Lee W L. Motor- and tail-dependent targeting of dynein to microtubule plus ends and the cell cortex [J]. Curr Biol, 2009, 19(3): 196-205.[8] Farkasovsky M, Kuntzel H. Yeast Num1p associates with the mother cell cortex during S/G2 phase and affects microtubular functions [J]. J Cell Biol, 1995, 131(4): 1003-1014. [9] Tang X, Punch J J, Lee W L. A CAAX motif can compensate for the PH domain of Num1 for cortical dynein attachment [J]. Cell Cycle, 2009, 8(19): 3182-3190.[10] Tang X, Germain B S, Lee W L. A novel patch assembly domain in Num1 mediates dynein anchoring at the cortex during spindle positioning [J]. J Cell Biol, 2012, 196(6): 743-756.[11] Heil-Chapdelaine R A, Oberle J R, Cooper J A. The cortical protein Num1p is essential for dynein-dependent interactions of microtubules with the cortex [J]. J Cell Biol, 2000, 151(6): 1337-1344.[12] Lackner L L, Ping H, Graef M, et al. Endoplasmic reticulum-associated mitochondria-cortex tether functions in the distribution and inheritance of mitochondria [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(6): E458-E467.[13] Ping H A, Kraft L M, Chen W, et al. Num1 anchors mitochondria to the plasma membrane via two domains with different lipid binding specificities [J]. J Cell Bio, 2016, 213(5): 513-524.[14] 阳小飞, 余意, 刘孟雪, 等. 稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建 [J]. 中南民族大学学报(自然科学版), 2017, 36(2): 38-41.[15] 王红莹, 杜嫚. 斑马鱼母源凝集素基因zfol的克隆和表达分析 [J]. 中南民族大学学报(自然科学版), 2016, 35(3): 26-29.。

roche cooktail蛋白酶成分罗氏鸡尾酒（Roche鸡尾酒）是一种用于生物科学研究的常用试剂盒，其中包含多种蛋白酶。

蛋白酶是一类能够加速蛋白质降解的酶类分子，它们具有多种不同的功能和特性。

以下将介绍Roche鸡尾酒中常见的蛋白酶成分。

1.胰蛋白酶（Trypsin）：胰蛋白酶是一种消化酶，由胰腺分泌，用于在消化过程中分解蛋白质。

在Roche鸡尾酒中，胰蛋白酶被用于体外细胞培养中，用于细胞的离析和传代。

它能够通过剪切蛋白质的肽键来降解蛋白质分子。

2.胰蛋白酶抑制剂（Trypsin Inhibitor）：胰蛋白酶抑制剂是一种能够抑制胰蛋白酶活性的分子。

在Roche鸡尾酒中，胰蛋白酶抑制剂被用于停止胰蛋白酶的活性，从而控制蛋白质降解的过程。

3.蛋白激酶抑制剂（Protein Kinase Inhibitors）：蛋白激酶抑制剂是一类能够抑制蛋白激酶活性的分子。

在Roche鸡尾酒中，蛋白激酶抑制剂被用于研究细胞信号传导的过程。

它们能够干扰蛋白激酶的活性，从而影响细胞内信号传递通路。

4.磷酸酶抑制剂（Phosphatase Inhibitors）：磷酸酶是一类能够去磷酸化蛋白质的酶。

在Roche鸡尾酒中，磷酸酶抑制剂用于抑制磷酸酶活性，从而保持蛋白质磷酸化状态。

5.蛋白酶抑制剂混合物（Protease Inhibitor Cocktail）：这是Roche鸡尾酒中的一个重要成分，它由多种蛋白酶抑制剂组成，能够抑制多种蛋白酶的活性。

蛋白酶抑制剂混合物能够保护蛋白质免受蛋白酶降解的影响，从而保持蛋白质的稳定性。

Roche鸡尾酒中的这些蛋白酶成分在生物科学研究中发挥着重要作用。

它们能够帮助研究人员保护蛋白质的完整性，提高实验的可靠性和准确性。

另外，这些蛋白酶成分还能够用于调节细胞内的信号传导过程，从而揭示细胞生物学的各个方面。

需要注意的是，Roche鸡尾酒中的蛋白酶成分不能用于食品加工或药品制造。

它们仅限于科学研究中的使用，需要严格遵守实验室安全操作规程。

染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation)（ChIP）1. 细胞交联、裂解准备：42ml 1×PBS(4.2ml 10×PBS+37.8ml water)[预冷]SDS lysis Bufer 放置室温Protease inhibitor cocktailⅡ置室温新鲜配制37%甲醛(1). 向已长满细胞的10cmDish 中（含10ml培养基）加入275ul 37%甲醛，轻轻混匀，室温静置10min(2)．同时，准备2个EP管，每管中吸取1ml预冷的1×PBS，在分别加入5ul protease inhibitor cocktail Ⅱ,放置冰上。

(3)．加入1ml 10×Glycine 于每个Dish中，以中和多余的甲醛。

(4)．旋转混匀，室温放置5min(5)．将Dish放置冰上(6)．弃去培养基，尽可能吸尽培养基，不要损伤细胞。

(7)．加10ml预冷的1×PBS洗细胞(8)．弃PBS，再重复洗一遍(9)．加1ml预冷PBS（含有1 ×Protease inhibitor cocktailⅡ）与Dish中（2步准备好）(10)．将细胞刮下来，收集至EP管中。

(11)．700g，4℃，离心2-5min，使细胞沉淀下来。

(12)．在离心过程中，准备lysis buffer(1ml SDS lysis Bufer中加入5ul Protease inhibitor cocktailⅡ)一般1×107 Hele cell, 用1ml SDS lysis Bufer(13)．弃上清（细胞沉淀物可冻存与-80℃）(14)．1ml SDS(含1×Protease inhibitor cocktailⅡ)重悬细胞沉淀物(15)．分装300-400 ul每管（细胞裂解液可在-80℃保存）(16)．超声2. 超声剪切DNA(1)．分装5ul细胞裂解液，用于琼脂糖凝胶电泳（unsheared DNA）(2)．冰上放置细胞裂解液，超声剪切DNA注：（摸条件，超声时要将细胞裂解液放置冰上，超声时产生大量热，会破坏DNA）(3)．离心10000-15000g，4℃，10min，去除不容物(4）．取5ul琼脂糖凝胶电泳（sheared DNA）(5)．将余下上清分装于新的EP管中，每管100ul注：（每100ul中包括1×106 个细胞，可以用作一次免疫沉淀用量）剪切后的染色质可以储存与-80℃2个月久。

不明觉厉！酰基-⽣物素交换法是个什么⿁？作者：⽼鹏（转载请注：解螺旋·医⽣科研助⼿）⼤家在读医学研究⽂献时常常会看到⼀种不明觉厉的研究技术，叫“Acyl-biotinyl Exchange”，翻译过来就是“酰基-⽣物素交换法”。

这种⽅法主要⽤于研究蛋⽩质所发⽣的翻译后修饰。

⼤多数蛋⽩分⼦都有多个不同的翻译后修饰机制，⽤以调节蛋⽩功能。

蛋⽩质最常见的翻译后修饰⽅式叫磷酸化，主要发⽣在丝氨酸、苏氨酸等残基位点上，常常通过特异性的抗体进⾏检测。

除了磷酸化之外，蛋⽩质的翻译后修饰的⽅式还有很多，例如糖基化、⼄酰化、甲基化、亚硝基化、⾕胱⽢肽化、棕榈酰化等等。

探索蛋⽩质翻译后修饰的⽣物学意义是是⽣命科学的研究热点之⼀。

对于医学研究⽽⾔，如果你在课题研究过程中发现某种新报道的蛋⽩质翻译后修饰刚好参与调控疾病过程中该蛋⽩的功能变化，那么恭喜你，⼀篇不错的好⽂章已经在不远处招⼿啦。

1酰基-⽣物素交换法是⼀种常见的检测蛋⽩质翻译后修饰的⽅法。

蛋⽩质的半胱氨酸残基上的巯基基团，由于其⾼反应性，很容易发⽣各种氧化还原反应或酰化反应。

酰基-⽣物素交换法的实质是将所要检测的翻译后修饰转化为酰基化的⽣物素基团。

整个交换过程要分三步完成：第⼀步，先封闭可能⼲扰检测的噪⾳，就是其他可被⽣物素酰基化的氨基酸残基基团；第⼆步，通过某种⽅式将所检测的翻译后修饰特异性的转变成可进⾏酰基化反应的状态，如还原态的巯基状态或游离的胺基状态；第三步，将⽣物素通过酰基化反应，结合那些转变⽣成的可发⽣翻译后修饰的氨基酸残基。

这样，原来的蛋⽩质翻译后修饰会交换成酰基化的⽣物素。

再通过可以选择性结合⽣物素的亲和素制备层析柱，就可以富集这些⽣物素化的蛋⽩，再通过抗体⼀⼀检测。

2亚硝基化修饰是⼀种发⽣在半胱氨酸残基巯基上的蛋⽩质翻译后修饰，对很多⼼脑⾎管疾病相关的蛋⽩功能有重要的调节效应。

以亚硝基化为例，可以帮助我们了解如何通过酰基-⽣物素交换法来研究蛋⽩质的翻译后修饰。