酶活性浓度的测定技术分析75页PPT

选购试剂盒时
要仔细阅读试剂盒说明书；
了解试剂盒所用方法的原理、试剂配方等；
选择IFCC或中华医学会检验学会推荐的常规方 法，或选择公认的测定方法。
使用时
定期对试剂盒的质量进行监测；
准确性、重复性、稳定性好，线性范围宽；
正向型试剂空白吸光度低、反向型试剂空白吸 光度高、试剂空白速率低、瓶间差小等。
如RBC内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高 100、15和7倍左右。
RBC释放的Hb在300～500nm可见光波段能 使吸光度值明显升高，干扰分光光度计的 测定。
.
6
1.1 Hb的吸光度曲线
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7
1.1 溶血影响的控制
减少溶血
体外溶血可通过实施样品制备技术的标准化加 以克服；
分清体内溶血与体外溶血。
血清置于空气中时，
血中CO2丧失极快，pH可在15min内由 7.4增至8.0，从而使对碱性环境敏感 的ACP活性迅速下降。
某些酶易受光线破坏，
CK可因吸收蓝光而引起酶发生不可逆 地失活，其失活程度与暴光时间的长 短成正比。
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15
1.5 副反应
副反应是指酶促反应体系中，除待测酶反应 外，其他非待测酶和物质引起的干扰待测酶 测定的反应。
ALT活性测定的反应式如下：
L 丙 2 氨 氧 酸 代 A 戊 L L T 谷 二 L 氨 丙 酸 酸
L 丙 N 酮 A H 酸 D L D H L 乳 N 酸 AD
.
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1.5 副反应的控制
可通过加入副反应抑制剂， 或对样品进行预处理等方法给予排除。 双试剂底物启动模式因不增加成本、不耗
.
12
1.3 贮存不同室温体液酶的稳定性 （活性变化小于10%）

（二）IFCC推荐的测定方法
以色素原GCNA为底物，甘氨酰甘氨酸为受体，GGT催化γ谷氨酰基团从GCNA转移至甘氨酰甘氨酸上，并游离出2-硝基 -5-氨基苯甲酸。后者的生成量与样品中的GGT活性成正比关 系，故测定405nm处的吸光度增量可计算出GGT的活性。
GCNA 双甘氨酸 pGHG7T.72 硝基 5 氨基苯甲酸 L 谷氨酰 甘氨酰甘氨酸
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
②2-硝基-5-氨基苯甲酸在410nm的摩尔消光系数为 7.96×103（pH为7.70），受pH和温度影响较大。若选择 401nm或405nm时需注意校正。
③由于产物摩尔消光系数较小，样品用量大，样品体积 分数0.0909，为了样品和反应液在37℃平衡，故需要孵育时 间180s和底物启动模式。
（一）测定方法概述
γ-L-谷氨酰对硝 基苯胺为底物
L-γ-谷氨酰-α（β） -萘胺为底物
方法灵敏度低， 底物溶解度差， 受溶血干扰较 大
可以连续监 测，有较好 的灵敏度和 准确性，但 底物溶解度 差
L-γ-谷氨酰-3-羧 基-4-硝基苯胺为
底物
IFCC推荐方 法
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
CNPF AFU CNP(黄色) L - 岩藻糖
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
CNPF法所采用CNP的解离常数(pKa)5.5与AFU的最适pH相 近，缩短了反应时间，无需样本空白，实现了AFU的连续监测 法测定。提高pH可提高CNP的离子化率，但过高的pH会影响 酶活性；该方法操作简便，测定时间短，灵敏度及抗干扰性都 有所提高。溶血仍有干扰。

七、考虑题
• 1、为什么要将试管中的淀粉酶原液置70℃水浴中 保温15min？
• 2、为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉 溶液分别置于40℃水浴中保温？
三、仪器和试剂
• 主要仪器: • (1)离心机 • (2)分光光度计 • 试剂 • (1)标准麦芽糖溶液(2mg/mL) • (2)1%3,5-二硝基水杨酸试剂 • (3)1%淀粉
四、操作步骤
1、标准曲线的制作(每2组4人做1标准曲线)
编号
1#(空白)
2#
3#
4#
5#
6#
2mg/mL麦芽糖标准液(mL)
表1－1不同谷物淀粉的比旋光度
品种
品种
小麦
182、7ຫໍສະໝຸດ 马铃薯黑麦184、0
小米
大麦
181、5
荞麦
水稻
185、9
燕麦
195、4 171、4 179、5 181、3
玉米
184、6
[α]D20
实验二 氨基酸的纸上层析
一、实验目的
通过对氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、实验原理
纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析,滤纸纤维上的－ OH具有亲水性,因此能吸附一层水作为固定相,而通常把有机 溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动,称为下行层析;自 下而上流动,称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之 间连续抽提,使物质在两相之间不断分配而得到分离。
1、主要仪器: (1)旋光仪 (2)电子天平(感量0、0001g) 2、试剂:
⑴1％盐酸溶液 ⑵30％硫酸锌溶液。 ⑶15％亚铁氰化钾溶液。
四、实验步骤
1、样品的处理 在电子天平上称取小麦粉2、5000g置于三角瓶中→加

１、酶液的制备
取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放 入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀 浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000g 水中离心10min，上清液转入25ml 容量瓶 中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取２次，上 清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下 保存备用。
２、过氧化物酶活性的测定
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中 A240 = AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
AS1, AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
四、实验结果
以每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活力单位
酶活力=—△—A ×D
0.01t
酶的比活力=—△A—×D
0.01Wt
式中， △A为反应时间内吸光度的变化；W为马铃 薯鲜重（g）；t为反应时间（min）；D为稀释倍数， 即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数
CAT过氧化氢酶活性测定方法
酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。 植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸（利用氧气并生成二氧化碳）
和共生性氮固定（将氮气(N2）解离为活性氮原子）。细胞被病原体 感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂。 其活性也与粮食品质之间有一定的相关性，是一项衡量谷物品质的 重要指标。
大家学习辛苦了，还是要坚持
过氧化氢酶的应用：
被用于食品包装，防止食物被氧化。 在纺织工业中，被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含
过氧化物的。 它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡

(2)该蛋白酶的提取工艺流程如下：
课题：探究酶保护剂的最适浓度和提取液的最适pH
单位时
提取液的pH
间内底
物的消 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.0.05 浓 度 0.06
【解析】 （1）审题结合图形和文字，在题目中已经提供了信息“食 品种类多，酸碱度范围广”，所以选择的食品添加剂应该有 较广的酸碱适应范围。从图形中，可以看出木瓜蛋白酶的适 应范围最广，所以可以选作食品添加剂。酶的活力，一般用 酶催化的底物消耗量或者产物生成量来表示。 （2）实验设计，应该明确实验目的：探究酶保护剂的最适 浓度和提取液的最适pH值，所以可以将酶保护剂的浓度和提 取液的pH值作为自变量，因变量为单位时间内底物的消耗量 。
10
20
30
40
50
组别
甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲乙丙
清除血渍时间(min) 67 66 88 52 51 83 36 34 77 11 12 68 9 11 67
清除油渍时间(min) 93 78 95 87 63 91 82 46 85 75 27 77 69 8 68
（4）加酶洗衣粉中的酶是特殊的化学物质包裹的，遇水后 包裹层很快溶解，释放出来的酶迅速发挥催化作用。请说明 这是否运用了酶的固定化技术及其理由。
29 ．（16分）食品种类多，酸碱度范围广。生物兴趣小组拟 探究在食品生产应用范围较广的蛋白酶，查阅相关文献，得知：
(2)该蛋白酶的提取工艺流程如下：
“汉水丑生的生物同行”超级群大型公 益 活动：历年高考题PPT版制作。本课
件为公益作品，版权所有，不得以任 何形式用于商业目的。2012年1月15日 ，汉水丑生标记。

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二、酶活力的测定
3.同位素测定法
用带有放射性同位素标记的底物经酶作用后得到产 物，通过适当的分离，测定产物的脉冲数即可换算出 酶的活力单位。 已知六大类酶几乎都可以用此方法测定。 通常用于底物标记的同位素有3H、14C、32P、35S和 131I等。
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二、酶活力的测定
优点：反应灵敏度极高，可直接用于酶活力的测定， 也可用于体内酶活性测定。特别是适用于低浓度的酶 和底物的测定。 缺点：操作繁琐，样品需分离，反应过程无法连续 跟踪，且同位素对人体有损伤作用。辐射猝灭会引起 测定误差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。
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二、酶活力的测定
4.电化学方法
第四章 酶活力的测定
第一节 酶的结构与性质(略) 第二节 酶活力测定方法
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第二节 酶活力测定方法
一、酶活力 二、酶活力的测定
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一、酶活力
1.概念
酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的 大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反 应速率来表示，两者呈线性关系。酶反应速率越大， 酶活力越高，反之越低。 酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或 产物的增加量来表示。在实际酶活性测定中一般以测 定产物的增加量为准。 酶活力的测定就是测定酶促反应的初速率。
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一、酶活力
3.酶的比活力
酶的比活力代表酶的纯度，通常用下式表示： 酶比活力=[ 酶活力单位数(U) / 蛋白质量(mg) ]
有时也采用每克(g)酶制剂或每毫升(mL)酶制剂含 有多少个活力单位来表示。 比活力的大小可用来比较每单位质量蛋白质的催化 能力。比活力是酶学研究及生产中经常使用的指标。

3、平衡法
目前临床应用较少，通过测定酶促反应开
始至反应达到平衡时产物或底物浓度的总变化
量来求出酶活性浓度的方法。
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三、连续监测法测定酶活性浓度
（一）种类
1.直接法
不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物 或产物理化性质的变化（如：A、荧光、旋光性，pH、电导 率、粘度等），从而计算出酶活性浓度。
(4)分析容器的污染
(5)沉淀形成
解决方法之一可通过试剂空白管检出并加以 校正，另一个有效途径就是不用单一试剂而改用 双试剂测定酶活性。
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四、工具酶
（一）工具酶
工具酶：酶学分析中作为试剂用于测定化 合物浓度或酶活性浓度的酶。
指示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。
（二）常用工具酶 常用工具酶多为氧化还原酶类 工具酶纯度不必要求过高 工具酶中杂质的含量有一定的限制
340nm处A的变化可以反映反应体系中NAD(P)H 量的增减，进而反映酶活性浓度。
（2） 利用一类人工合成的所谓色原性底物， 其本身为无色或微黄色，酶作用后生成有色化合物。
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（1）在原反应体系中加入一些试剂，其只和酶反应 物迅速作用，产生可被检出的物质，但该试剂不和 酶反应，也不影响酶的活性。
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1. 酶偶联反应时相
酶偶联反应一开始不能反映酶活性，在反应中存在几 个时相。以临床常规酶学分析中常见的ALT的检测为例， 在该酶偶联体系中的指示酶为脱氢酶，反应原理如下：
L-丙氨酸＋α-酮戊二酸 ALT α-丙酮酸＋ L-谷氨酸 α-丙酮酸＋NADH LDH 乳酸＋NAD+

Thank you
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
高中生物高二生物PPT课件酶活力的 测定
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克

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淀粉酶活性测定方法主要是天然淀粉底物 法，这种方法碘淀粉比色法操作简便,结果可靠 在临床上得到广泛的应用。
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实验目的：
掌握：碘-淀粉比色法测定血清淀粉酶的原理 熟悉：血清淀粉酶测定的临床应用 了解：碘-淀粉比色法测定血清淀粉酶的方法学
评价
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两个原则
一是在零级反应期测定,即V=Vmax=常 数，底物减少量或产物生成量与反应时间 成正比；
二是反应速率与酶量成线性期测定。
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酶促反应进程
1.延滞期 是指酶促反应开始 至达到最大反应速度所需 要的时间
2.线性期 是指酶促反应速度 保持恒定的时期，不受底 物浓度的影响
3.非线性期 随着反应时间的 延长，底物消耗越来越明 显，酶促反应速度明显下 降，偏离线性而进入非线 性期
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预习
• 第四章 体液蛋白质测定 • 实验22 、实验23
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血清淀粉酶增高对急性胰腺炎有诊断价值。
急性胰性炎时,血和尿中的AMY显著增高,急性胰 腺炎发病后8-12小时血清AMY开始增高,12-24小 时达高峰,2-5天下降至正常.如超过500U/L有诊断 意义,达350U/L时应怀疑此病。而尿AMY约于发 病后12-24小时开始升高,下降也比血清AMY慢， 因此，在急性胰腺炎后期测定尿AMY更有价值.同 时由于它的测定方法简单,快速,一直被用于胰腺炎 的诊断和急腹症的鉴别诊断。
A空白管 - A测定管 800 A空白管
参考范围：血清80-180U；尿液100-1200U