细胞爬片用小玻片处理.doc

细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
第二天：
6. 加荧光二抗：PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；
注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；
8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

细胞爬片全过程经验总结细胞爬片的制备是免疫细胞化学、免疫荧光、TUNEL凋亡检测的第一步，也是获得一份漂亮的实验结果的关键步骤。

Easylabs站长根据自已多年的经验，奉献此文，希望对大家的实验有所帮助。

【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。

如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。

烤干后可放入超净台中。

5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。

但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL 等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

细胞载玻片爬片培养法进行免疫组化染色方法介绍天津市灏洋生物制品科技有限责任公司郑斌徐彬传统的细胞爬片中使用24孔板或96孔板，因为是塑料材质不利于抗原热修复，而盖玻片较薄，易碎不容易取出，二者均存在一定的缺点。

本实验采用体外细胞载玻片爬片培养法，便于做热修复，同时操作较方便、简单、实用。

1 材料1．1 载玻片的处理：用肥皂水将载玻片洗净，自来水冲洗，晾干，再将载玻片浸泡在洗液中2~3小时，取出后再用自来水冲净，蒸馏水冲洗三遍，用干净的纱布将载玻片擦干，放在饭盒中，置170℃干烤5小时消毒灭菌。

1．2 人乳腺癌细胞系T47-D、人骨肉瘤细胞系U2OS。

1．3 仪器倒置显微镜、光学显微镜、二氧化碳培养箱、隔水式电热恒温培养箱等。

1．4 试剂胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、免疫组化试剂盒、无水乙醇、抗葡萄糖转移酶（Glut-1）多克隆抗体、抗脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（APE1）单克隆抗体、抗血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体、PBS(含0.01M 磷酸盐缓冲液，0.85%NaCl，pH 7.2~7.4) 、0.1 M枸橼酸缓冲液（pH 6.2~6.4）、分化液（10%乙醇、0.5%盐酸）、二甲基联苯胺（DAB）等。

2 方法2．1 细胞爬片培养取人乳腺癌细胞系T47-D细胞及人骨肉瘤细胞系U2OS细胞各一瓶，用吸管吸除培养瓶内旧培养液，向培养瓶内加入2ml 0.25%胰蛋白酶,覆满瓶底。

室温放置5分钟后镜下观察，发现细胞变圆、细胞间隙增大后，立即终止消化，翻转培养瓶，使瓶底向上。

将胰蛋白酶吸去，加入约2ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，将细胞从瓶壁上吹打下来，制成细胞悬液，滴于已处理好的载玻片上，每张片子1~2滴，注意:滴于载玻片后1/3的位置，且不能有汽泡。

放在37℃ 5%CO2培养箱中继续培养过夜。

2．2 细胞的固定培养箱取出，用PBS将培养液洗去，放 将已培养过夜的细胞爬片从5%CO2在冷乙醇中室温固定30分钟后，取出爬片放置在切片盒内-20℃储存，待免疫组化染色。

解决液基细胞爬片质量的新办法细胞粘附载玻片处理方法有以下8种：1、超强粘附细胞载玻片处理方法：由于国内、国外市场迫切需求，中山市康乃欣生物医疗科技有限公司研发出超强细胞载玻片粘附技术，通过酸洗—离子水洗—碱洗—离子水洗—蒸馏水浸泡--烘干—康乃欣处理液浸泡—烘干--康乃欣粘附剂浸泡--烘干—真空包装，精制而成。

康乃欣超强粘附载玻片无毒无害、安全环保，性能稳定，保质2年，康乃欣粘附载玻片的细胞粘附功能超过现有常规各种粘附载波片，有超强吸附各种细胞类型和生物组织的粘附和贴壁功能，且无细胞毒性。

适用于病理组织片、冰冻组织片、各种液基细胞样本，可快速、牢固的吸附组织和细胞。

无需干燥，在湿润的条件下，即可耐受固定、染色、脱水、洗涤等处理造成的样本脱落；也适用于处理易漂浮细胞；不仅显著增加吸附细胞数量，还使细胞容易耐受洗涤、换液、药物处理造成的脱落。

特别是液基TCT防脱载玻片表面带有正电荷，适用于液基细胞膜式、离心、沉降式制片，产品具有制片效果好，成片细胞均匀，观片清晰等优点2、Vectabond粘附法，特点成本高、配置复杂、效果一般。

3、APES硅化法，特点：调配简单、现配现用；缺陷，效果不佳，滑片、脱片现象。

4、胶原蛋白涂片法，特点：价格贵、成本高、难批量，缺陷有效期短，背景作色、干扰源作色、细胞重叠。

5、PE、壳聚糖、葡聚糖、乳胶等方法效果不尽人意。

6、鸡清涂片法：鸡蛋打破提取蛋清，在烧杯中用磁力棒拌半小时，直至混悬多轮气泡，去掉气泡，留下明澈液体。

2-8℃下贮藏。

每一张载玻片约10微升涂片，均匀涂片无气泡，然后45度烘干。

特点：A、长处是简洁，此法对比合适小量的且不通过抗原修正处置的免疫组化试验。

B、缺陷是涂改好的片子不易保留，经抗原修正处置后较易掉片，背景容易作色。

7、铬矾明胶法：配制方法：铬矾（也即硫酸铬钾，带12个结晶水）0.5克,明胶1克,蒸馏水200ml。

配法：将1克明胶溶解在100ml蒸馏水中，70℃恒温箱内密封过夜，再加硫酸铬钾，用蒸馏水定容至200ml，加少量酚结晶，过滤，4℃保留备用。

1.转染48小时后，弃去旧液，1ml PBS洗两遍用BD公司的固定透膜液400ul （Fixation and Permeabilization Solution）于4度冰箱内固定透膜20分钟后，PBS洗两遍
2.用弯曲的针头挑起爬片，镊子夹出置于载玻片上，内源性过氧化物酶阻断剂室温（无色液体）孵育10分钟
3.吸水纸吸去阻断剂后将玻片在摇床上PBS中洗3次，每次5分钟。

（若洗的次数多则细胞脱片程度也有可能加大，摇洗的力度也不宜过高）
4.滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10分钟，用吸水纸从一侧吸去，勿洗。

5滴加20倍稀释的单抗，800倍稀释的感染血清，于湿盒内37度孵育2小时。

6.吸水纸吸去稀释后的一抗，在摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

7.滴加试剂B（黄色液体）室温孵育10分钟。

8.吸水纸吸去试剂B后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

9.滴加试剂C（橙色液体）室温孵育10分钟。

10.吸水纸吸去试剂C后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

11.显色剂DAB显色。

细胞爬片中玻片的处理：
方法一：先用无水乙醇脱脂,再用多聚赖氨酸处理,然后高压灭菌,然后就可以放入培养板中。

方法二：玻片和一般玻璃器皿的洗涤一样，也就是也要浸洗液，然后冲洗，蒸馏水冲洗后干燥，然后高压灭菌，这样处理过的玻片也没有问题，这个方法比较简单。

方法三:新玻片先用自来水冲洗，然后放到烤箱中烤干，再泡酸24小时，然后用自来水冲洗干净，要一片一片洗多冲几遍，直到无酸残留为止，最后用双蒸水荡三遍即可拿去高压备用。

【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。

如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。

烤干后可放入超净台中。

5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。

但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

末取出的可接着继续培养。

【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。

当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。

细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天：1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；第二天：6. 加荧光二抗：PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

运动与健康题目：体育锻炼对运动系统的影响指导老师：欧阳靜仁班级：热能092班姓名：***学号：************摘要：这篇文章通过对人体运动系统组成的介绍，以及体育锻炼对运动系统的作用和影响的一点点描述，给平时不重视锻炼的人说明了体育锻炼的好处，希望能够有更多的人重视体育锻炼。

本文部分地方参考相关文件，可信度在一定程度上得到提高，同时也未免有疏落之处，请指正。

参考：/view/63163.htm/view/5df244d728ea81c758f5787c.html关键词：骨，骨连接，骨骼肌，支架作用、保护作用和运动作用，合理的体育锻炼，三磷酸腺苷（ATP）酶前言体育锻炼与我们息息相关，在我们的身边，无时无刻都有人在运动，各种球类运动、跑步、游泳等等...大家都知道体育锻炼对人体是有好处的，然而具体有些什么好处呢？这个答案有多少人知道。

【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。

如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。

烤干后可放入超净台中。

5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。

但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

末取出的可接着继续培养。

【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。

当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。

细胞爬片荧光原位杂交流程
细胞爬片荧光原位杂交实验步骤
1. 准备细胞爬片：选择适当的细胞爬片，如盖玻片或载玻片，并进行适当的处理，如涂布血清或明胶。

2. 细胞培养与固定：将细胞种植在爬片上，培养一定时间后进行固定，常用的固定剂包括甲醇和冰醋酸等。

3. 脱蜡与水化：将固定好的爬片放入脱蜡缸中，按照规定程序进行脱蜡，然后进行水化。

4. 通透处理：用一定浓度的盐酸或甲酸对细胞进行通透处理，使探针能够进入细胞内。

5. 杂交：将标记有荧光染料的核酸探针与细胞中的核酸进行杂交，通常在一定温度下进行一定时间的杂交。

6. 洗涤：杂交后需要进行充分的洗涤，以去除未结合的探针和杂质。

7. 观察：在荧光显微镜下观察杂交结果，记录荧光信号的位置、强度等信息。

8. 数据分析：对观察到的荧光信号进行分析，计算荧光密度、阳性率等指标，并进行统计学处理。

需要注意的是，荧光原位杂交技术是一种相对复杂的技术，需要一定的实验技能和经验。

在进行实验前，应充分了解实验原理、操作步骤和注意事项，严格遵守实验室规章制度和操作规程。