细胞爬片用小玻片处理.doc

细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
第二天：
6. 加荧光二抗：PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；
注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；
8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

细胞爬片全过程经验总结细胞爬片的制备是免疫细胞化学、免疫荧光、TUNEL凋亡检测的第一步，也是获得一份漂亮的实验结果的关键步骤。

Easylabs站长根据自已多年的经验，奉献此文，希望对大家的实验有所帮助。

【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。

如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。

烤干后可放入超净台中。

5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。

但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL 等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

细胞载玻片爬片培养法进行免疫组化染色方法介绍天津市灏洋生物制品科技有限责任公司郑斌徐彬传统的细胞爬片中使用24孔板或96孔板，因为是塑料材质不利于抗原热修复，而盖玻片较薄，易碎不容易取出，二者均存在一定的缺点。

本实验采用体外细胞载玻片爬片培养法，便于做热修复，同时操作较方便、简单、实用。

1 材料1．1 载玻片的处理：用肥皂水将载玻片洗净，自来水冲洗，晾干，再将载玻片浸泡在洗液中2~3小时，取出后再用自来水冲净，蒸馏水冲洗三遍，用干净的纱布将载玻片擦干，放在饭盒中，置170℃干烤5小时消毒灭菌。

1．2 人乳腺癌细胞系T47-D、人骨肉瘤细胞系U2OS。

1．3 仪器倒置显微镜、光学显微镜、二氧化碳培养箱、隔水式电热恒温培养箱等。

1．4 试剂胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、免疫组化试剂盒、无水乙醇、抗葡萄糖转移酶（Glut-1）多克隆抗体、抗脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（APE1）单克隆抗体、抗血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体、PBS(含0.01M 磷酸盐缓冲液，0.85%NaCl，pH 7.2~7.4) 、0.1 M枸橼酸缓冲液（pH 6.2~6.4）、分化液（10%乙醇、0.5%盐酸）、二甲基联苯胺（DAB）等。

2 方法2．1 细胞爬片培养取人乳腺癌细胞系T47-D细胞及人骨肉瘤细胞系U2OS细胞各一瓶，用吸管吸除培养瓶内旧培养液，向培养瓶内加入2ml 0.25%胰蛋白酶,覆满瓶底。

室温放置5分钟后镜下观察，发现细胞变圆、细胞间隙增大后，立即终止消化，翻转培养瓶，使瓶底向上。

将胰蛋白酶吸去，加入约2ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，将细胞从瓶壁上吹打下来，制成细胞悬液，滴于已处理好的载玻片上，每张片子1~2滴，注意:滴于载玻片后1/3的位置，且不能有汽泡。

放在37℃ 5%CO2培养箱中继续培养过夜。

2．2 细胞的固定培养箱取出，用PBS将培养液洗去，放 将已培养过夜的细胞爬片从5%CO2在冷乙醇中室温固定30分钟后，取出爬片放置在切片盒内-20℃储存，待免疫组化染色。

解决液基细胞爬片质量的新办法细胞粘附载玻片处理方法有以下8种：1、超强粘附细胞载玻片处理方法：由于国内、国外市场迫切需求，中山市康乃欣生物医疗科技有限公司研发出超强细胞载玻片粘附技术，通过酸洗—离子水洗—碱洗—离子水洗—蒸馏水浸泡--烘干—康乃欣处理液浸泡—烘干--康乃欣粘附剂浸泡--烘干—真空包装，精制而成。

康乃欣超强粘附载玻片无毒无害、安全环保，性能稳定，保质2年，康乃欣粘附载玻片的细胞粘附功能超过现有常规各种粘附载波片，有超强吸附各种细胞类型和生物组织的粘附和贴壁功能，且无细胞毒性。

适用于病理组织片、冰冻组织片、各种液基细胞样本，可快速、牢固的吸附组织和细胞。

无需干燥，在湿润的条件下，即可耐受固定、染色、脱水、洗涤等处理造成的样本脱落；也适用于处理易漂浮细胞；不仅显著增加吸附细胞数量，还使细胞容易耐受洗涤、换液、药物处理造成的脱落。

特别是液基TCT防脱载玻片表面带有正电荷，适用于液基细胞膜式、离心、沉降式制片，产品具有制片效果好，成片细胞均匀，观片清晰等优点2、Vectabond粘附法，特点成本高、配置复杂、效果一般。

3、APES硅化法，特点：调配简单、现配现用；缺陷，效果不佳，滑片、脱片现象。

4、胶原蛋白涂片法，特点：价格贵、成本高、难批量，缺陷有效期短，背景作色、干扰源作色、细胞重叠。

5、PE、壳聚糖、葡聚糖、乳胶等方法效果不尽人意。

6、鸡清涂片法：鸡蛋打破提取蛋清，在烧杯中用磁力棒拌半小时，直至混悬多轮气泡，去掉气泡，留下明澈液体。

2-8℃下贮藏。

每一张载玻片约10微升涂片，均匀涂片无气泡，然后45度烘干。

特点：A、长处是简洁，此法对比合适小量的且不通过抗原修正处置的免疫组化试验。

B、缺陷是涂改好的片子不易保留，经抗原修正处置后较易掉片，背景容易作色。

7、铬矾明胶法：配制方法：铬矾（也即硫酸铬钾，带12个结晶水）0.5克,明胶1克,蒸馏水200ml。

配法：将1克明胶溶解在100ml蒸馏水中，70℃恒温箱内密封过夜，再加硫酸铬钾，用蒸馏水定容至200ml，加少量酚结晶，过滤，4℃保留备用。

1.转染48小时后，弃去旧液，1ml PBS洗两遍用BD公司的固定透膜液400ul （Fixation and Permeabilization Solution）于4度冰箱内固定透膜20分钟后，PBS洗两遍
2.用弯曲的针头挑起爬片，镊子夹出置于载玻片上，内源性过氧化物酶阻断剂室温（无色液体）孵育10分钟
3.吸水纸吸去阻断剂后将玻片在摇床上PBS中洗3次，每次5分钟。

（若洗的次数多则细胞脱片程度也有可能加大，摇洗的力度也不宜过高）
4.滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10分钟，用吸水纸从一侧吸去，勿洗。

5滴加20倍稀释的单抗，800倍稀释的感染血清，于湿盒内37度孵育2小时。

6.吸水纸吸去稀释后的一抗，在摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

7.滴加试剂B（黄色液体）室温孵育10分钟。

8.吸水纸吸去试剂B后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

9.滴加试剂C（橙色液体）室温孵育10分钟。

10.吸水纸吸去试剂C后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

11.显色剂DAB显色。

细胞爬片中玻片的处理：
方法一：先用无水乙醇脱脂,再用多聚赖氨酸处理,然后高压灭菌,然后就可以放入培养板中。

方法二：玻片和一般玻璃器皿的洗涤一样，也就是也要浸洗液，然后冲洗，蒸馏水冲洗后干燥，然后高压灭菌，这样处理过的玻片也没有问题，这个方法比较简单。

方法三:新玻片先用自来水冲洗，然后放到烤箱中烤干，再泡酸24小时，然后用自来水冲洗干净，要一片一片洗多冲几遍，直到无酸残留为止，最后用双蒸水荡三遍即可拿去高压备用。

【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。

如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。

烤干后可放入超净台中。

5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。

但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

末取出的可接着继续培养。

【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。

当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。

细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天：1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；第二天：6. 加荧光二抗：PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

运动与健康题目：体育锻炼对运动系统的影响指导老师：欧阳靜仁班级：热能092班姓名：***学号：************摘要：这篇文章通过对人体运动系统组成的介绍，以及体育锻炼对运动系统的作用和影响的一点点描述，给平时不重视锻炼的人说明了体育锻炼的好处，希望能够有更多的人重视体育锻炼。

本文部分地方参考相关文件，可信度在一定程度上得到提高，同时也未免有疏落之处，请指正。

参考：/view/63163.htm/view/5df244d728ea81c758f5787c.html关键词：骨，骨连接，骨骼肌，支架作用、保护作用和运动作用，合理的体育锻炼，三磷酸腺苷（ATP）酶前言体育锻炼与我们息息相关，在我们的身边，无时无刻都有人在运动，各种球类运动、跑步、游泳等等...大家都知道体育锻炼对人体是有好处的，然而具体有些什么好处呢？这个答案有多少人知道。

【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。

如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。

烤干后可放入超净台中。

5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。

但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

末取出的可接着继续培养。

【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。

当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。

细胞爬片荧光原位杂交流程
细胞爬片荧光原位杂交实验步骤
1. 准备细胞爬片：选择适当的细胞爬片，如盖玻片或载玻片，并进行适当的处理，如涂布血清或明胶。

2. 细胞培养与固定：将细胞种植在爬片上，培养一定时间后进行固定，常用的固定剂包括甲醇和冰醋酸等。

3. 脱蜡与水化：将固定好的爬片放入脱蜡缸中，按照规定程序进行脱蜡，然后进行水化。

4. 通透处理：用一定浓度的盐酸或甲酸对细胞进行通透处理，使探针能够进入细胞内。

5. 杂交：将标记有荧光染料的核酸探针与细胞中的核酸进行杂交，通常在一定温度下进行一定时间的杂交。

6. 洗涤：杂交后需要进行充分的洗涤，以去除未结合的探针和杂质。

7. 观察：在荧光显微镜下观察杂交结果，记录荧光信号的位置、强度等信息。

8. 数据分析：对观察到的荧光信号进行分析，计算荧光密度、阳性率等指标，并进行统计学处理。

需要注意的是，荧光原位杂交技术是一种相对复杂的技术，需要一定的实验技能和经验。

在进行实验前，应充分了解实验原理、操作步骤和注意事项，严格遵守实验室规章制度和操作规程。

第一，盖玻片需要过酸，并且自来水、蒸馏水冲洗干净。

两张或者以上的玻片很容易因为虹吸作用粘到一起，很容易冲不干净，很容易把两张完全重叠在一起的玻片当成一张，一定要看清楚，晾干片子最好是在消毒饭盒中进行，饭盒底面放上纱布，将玻片斜靠在饭盒侧壁，玻片正面不要接触纱布，否则会粘上毛毛的。

然后高压蒸汽灭菌，烤箱中烤干。

第二，爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。

这一步至关重要，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。

用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。

第三，传代消化下来的细胞一定不要过多稀释，将浓一点的细胞悬液吹打混匀后滴在玻片上，几个小时后再追加培养基。

第四，玻片在培养皿中容易漂起，如果事先在皿中铺上液体很可能会不容易揭下来，或者揭下来时出印子在镜下很难看。

漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的，这时背面的细胞必须去除，挺难操作的，用PBS冲洗可能会伤到正面的细胞，用小镊子夹玻片很容易夹碎，也很容易脱落，小心点好。

第五，将玻片拿出后一定要记好哪边是正面，最好做玻片时将玻片切成长方形的。

目前市场售的多为18mm x 18mm的盖玻片，或者24mmx24mm的盖玻片，正方形，很难分辨反正面，在某个角上打个缺口，对正方形是不中用的。

可以用小砂轮切一下改成长方形，至于在某个角上用砂轮做个标记，理论上很简单，实际操作有难度。

第六，上面步骤都没问题后，玻片就需要进一步处理了，这里有几个细节，分述如下：1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏，每一步后都要冲洗2-3次，有时还没等试验做完，大部分细胞已经被冲掉了，呵呵！我当时欲哭无泪啊！2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4°C的好，有人认为37°C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4°C冰箱中。

细胞免疫荧光步骤（仅供参照）方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。

3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。

4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS 中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。

5.接下来二抗孵育步骤同上。

6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。

7.抗体很重要，不能有非特异性结合。

你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。

8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。

如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit 和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。

2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。

抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey 血清。

5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。

为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。

在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。

能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。

1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。

2、用自来水冲洗5min。

3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。

4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。

5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。

6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。

二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。

同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。

1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。

2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。

对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。

3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。

主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。

另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。

细胞生物学实验报告实验三细胞爬片1引言1.1 实验目的1．巩固细胞传代技术。

2．掌握细胞爬片的方法。

3. 为细胞骨架的观察提供实验材料。

1.2 实验原理细胞爬片：细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，切片，细胞涂片，原位杂交等。

细胞爬片采用的玻片可以是普通的盖玻片也可以用细胞爬片专用玻片。

使用普通盖玻片时，要按照玻璃器皿的清洗方法进行清洗，并进行高压灭菌。

专用玻片通常已经过处理可直接使用。

2实验仪器、试剂及操作步骤2.1 实验仪器超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、75％酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒（头）、废液缸、镊子、玻璃平皿、盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿（六孔板）、培养瓶等2.2 实验试剂DMEM培养基、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等2.3 实验材料鼠胚成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞2.4 实验步骤1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。

2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。

3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。

4.在显微镜下观察细胞生长状况。

5.用灭菌小镊子将处理好盖玻片轻轻放入35mm培养皿中。

6.打开细胞瓶盖并在酒精灯上轻轻烧口消毒，倒掉或吸出培养基。

7.加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞，使其湿润整个细胞层，弃胰酶，再加入一滴管胰酶，盖好瓶盖。

8.显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、变圆，细胞边界清晰时，即可竖立或翻转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处弃胰酶。

9.加两滴管的DMEM培养基反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下，滴管轻轻吹打，混匀，成细胞悬液，进行细胞计数。

取少量细胞悬液与EP试管里，检查计数板并清洗，先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续2-3次，直至充满计数板和盖玻片间的空隙。

将加好样品的计数板置于显微镜载物台的中央，然后按下列步骤操作：1）找计数室，先在低倍镜下寻找计数板上的大方格位置。

【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。

如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。

烤干后可放入超净台中。

5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。

但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

末取出的可接着继续培养。

【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。

当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。

细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。

爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。

一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。

培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。

最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。

同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。

注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。

抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)PBS漂洗2次，每次5min1%BSA封闭30min加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1hPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml DAPI染色2min抗淬灭封片剂封片2.5% DABCO (w/v)抗淬灭封片剂50mM Tris(pH8.0)90%甘油0.25g DABCO9ml甘油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存0.5ml ddH2O。

细胞爬片的方法与心得
【爬片的准备】
1、爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；
2、应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；
3、将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者培养皿（一定是玻璃的）中烘干后进行高压消毒。

【培养板的准备】
1、泡酸过夜
2、冲洗，烘干（1、2步骤与前大致相同）
3、放入超净工作台用紫外线照1～2小时就可以用了（在照之前可以将爬片一并放入，若细胞贴壁能力不强，可经多聚赖氨酸浸片后放入。

贴壁能力强的话，就可以省略了，进行紫外线消毒）爬片可以先浸入消毒后的PBS内，紧接着放入培养板内。

目的：浸过PBS的爬片依靠表面的液体，可以用培养板孔底贴和紧密，以利于细胞长到爬片上。

【细胞爬片】
1、胰酶消化细胞后计数
2、根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
3、第二天即可进行干预措施。