PCR技术的原理及其应用

192018年11月总第301期ISSN1672-1438CN11-4994/T

作者简介：安钢力，医学硕士，实验师。聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技

术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一

种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、

易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天

或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医

学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它

的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性

分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增

反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。

人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方

法进行了许多探索研究，直到1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出了一种新的定量试验技术—荧

光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitative PCR, RT-

qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异

性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用

与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模

板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，

具有里程碑意义。目前，此项技术已应用于干细胞研

究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研

究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生

物科技等多领域研究中[1]。本文对实时荧光定量PCR

的原理、分类和应用进行阐述。

1 实时荧光定量PCR技术的原理

real-time quantitative PCR技术是指在PCR反应体

系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实

时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行

定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比

较重要。(1)荧光域值(threshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值

设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理：

①引物长度

一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。

在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。

总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

② GC含量

一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。

③退火温度

退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。

④避免扩增模板的二级结构区域

选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。

PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则

1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

3、引物内部不应出现互补序列。

4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

6、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

7、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

PCR的技术原理及应用

1. PCR的技术原理

PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链反应，是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因工程、疾病诊断及法医学等领域。PCR能够在体外复制一小段DNA序列，从而产生大量数量的目标DNA片段。

PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火和扩增。

1. 变性（Denaturation）：在高温（通常为94-96摄氏度）下，DNA双链被破坏，使DNA单链暴露出来。

2. 退火（Annealing）：在较低温度（通常为50-65摄氏度），引物（primers）与DNA单链特异性结合，形成DNA-RNA杂交体。引物是一段DNA片段，用于定义PCR扩增的起始和终止位置。

3. 扩增（Extension）：在中高温度（通常为72摄氏度），热稳定的DNA聚合酶（如Taq聚合酶）在引物的指导下，以DNA单链为模板合成新的DNA链。

经过多个PCR循环，可以扩增出相当数量的目标DNA片段。

2. PCR的应用

PCR技术被广泛应用于许多领域，以下是PCR的几个主要应用：

2.1 DNA测序

PCR技术可以用于DNA测序，即通过扩增DNA的目标片段，使其数量足够进行测序。这种方法被广泛应用于基因组学、遗传学以及疾病研究领域。PCR扩增出的大量DNA可以通过测序方法，如Sanger测序或高通量测序，对DNA序列进行分析和解读。

2.2 基因工程

PCR技术在基因工程中起着至关重要的作用。它可以在合成基因和重组蛋白的过程中，通过扩增目标DNA片段，使得基因工程变得简单、快速和可行。PCR技术被广泛应用于构建基因表达载体、制备基因突变体和表达蛋白等方面。

2.3 疾病诊断

PCR技术在疾病诊断中有着重要的应用。例如，在传染病的诊断中，通过检测致病微生物的DNA或RNA，可以迅速、灵敏地确定感染病原体。此外，PCR技术还可以用于基因突变的检测，早期癌症的筛查，以及非侵入性产前基因检测等方面。 2.4 法医学应用