192018年11月总第301期ISSN1672-1438CN11-4994/T
作者简介：安钢力，医学硕士，实验师。聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技
术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一
种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、
易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天
或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医
学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它
的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性
分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增
反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。
人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方
法进行了许多探索研究，直到1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出了一种新的定量试验技术—荧
光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitative PCR, RT-
qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异
性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用
与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模
板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，
具有里程碑意义。目前，此项技术已应用于干细胞研
究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研
究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生
物科技等多领域研究中[1]。本文对实时荧光定量PCR
的原理、分类和应用进行阐述。
1 实时荧光定量PCR技术的原理
real-time quantitative PCR技术是指在PCR反应体
系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实
时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行
定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比
较重要。(1)荧光域值(threshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值
PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
PCR引物设计
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
引物设计的基本原则
1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
3、引物内部不应出现互补序列。
4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
6、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。
7、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
PCR的技术原理及应用
1. PCR的技术原理
PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链反应，是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因工程、疾病诊断及法医学等领域。PCR能够在体外复制一小段DNA序列，从而产生大量数量的目标DNA片段。
PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火和扩增。
1. 变性（Denaturation）：在高温（通常为94-96摄氏度）下，DNA双链被破坏，使DNA单链暴露出来。
2. 退火（Annealing）：在较低温度（通常为50-65摄氏度），引物（primers）与DNA单链特异性结合，形成DNA-RNA杂交体。引物是一段DNA片段，用于定义PCR扩增的起始和终止位置。
3. 扩增（Extension）：在中高温度（通常为72摄氏度），热稳定的DNA聚合酶（如Taq聚合酶）在引物的指导下，以DNA单链为模板合成新的DNA链。
经过多个PCR循环，可以扩增出相当数量的目标DNA片段。
2. PCR的应用
PCR技术被广泛应用于许多领域，以下是PCR的几个主要应用：
2.1 DNA测序
PCR技术可以用于DNA测序，即通过扩增DNA的目标片段，使其数量足够进行测序。这种方法被广泛应用于基因组学、遗传学以及疾病研究领域。PCR扩增出的大量DNA可以通过测序方法，如Sanger测序或高通量测序，对DNA序列进行分析和解读。
2.2 基因工程
PCR技术在基因工程中起着至关重要的作用。它可以在合成基因和重组蛋白的过程中，通过扩增目标DNA片段，使得基因工程变得简单、快速和可行。PCR技术被广泛应用于构建基因表达载体、制备基因突变体和表达蛋白等方面。
2.3 疾病诊断
PCR技术在疾病诊断中有着重要的应用。例如，在传染病的诊断中，通过检测致病微生物的DNA或RNA，可以迅速、灵敏地确定感染病原体。此外，PCR技术还可以用于基因突变的检测，早期癌症的筛查，以及非侵入性产前基因检测等方面。 2.4 法医学应用
PCR技术是一种分子生物学技术，用于扩增和扩增特定的DNA片段。它可以被认为是一种特殊的体外DNA复制。 PCR的最大特点是可以大大增加痕量DNA。
PCR技术的基本原理：类似于DNA的自然复制过程，其特异性取决于靶序列两端的互补寡核苷酸引物。
PCR（聚合酶链反应）是利用DNA变性在体外将在95°C时变成单链，低温（通常在60°C左右）的引物和单链根据碱基互补配对的原理，然后进行调节该温度至DNA聚合酶的最佳反应温度（约72℃），DNA聚合酶沿磷酸酯至戊糖的方向（5'- 3'）。
基于聚合酶的PCR仪器实际上是一个温度控制装置，可以控制变性温度，变性温度和延伸温度。
扩展数据
PCR引物设计
PCR反应中有两种引物，即5'末端引物和3'引物。设计引物时，单条DNA链（通常是信息链）被用作基础。 5'末端引物与位于扩增片段的5'末端的小DNA片段相同，并且3'末端引物与位于扩增片段的3'末端的小DNA序列互补。
底漆设计的基本原理
1.引物长度：15-30bp，常用约20bp。
2.底漆底：G + C含量以40-60％为宜，G + C扩增效果太差，G + C过多易出现非特异性条带。应随机分配ATGC，以避免引用超过5个嘌呤或嘧啶核苷酸。 3.引物中不应有互补序列。
4.两个引物之间不应有互补序列，特别是要避免3'末端的互补重叠。
5.引物与非特异性扩增区序列的同源性不应超过70％。在待扩增区域之外不应有完整的互补序列，否则将容易引起非特异性扩增。
6.引物的3'末端，尤其是最后一个碱基和最后一个碱基，应严格配对。最佳选择是g和C。
7.可以修饰引物的5'端。例如，添加限制酶位点，引入突变位点，标记生物素，荧光物质，地高辛，并添加其他短序列，包括起始密码子和终止密码子。
