紫外分光光度法测定植物黄酮含量的方法
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紫外分光光度法测定植物黄酮含量的方法
紫外分光光度法是检测植物黄酮含量的最有效的方法，紫外分光光度的检测方法有很多，本文主要介绍了直接测定法、显色测定法、差示测定法、多波长法测定的方法，这些方法的应用条件不同，需要结合实际，综合考虑后选择适用的测定方法，这样才能提高测定的工作效率，保证测定结果的正确性。通过对植物黄酮含量的测量，可以掌握黄酮类化合物含量的原理，还能对植物的特性进行科学的分析，具有一定的医药价值。
标签：紫外分光光度法 植物 黄酮 方法
【文献标识码】B
【文章编号】1004-4949（2014）11-0709-02
黄酮类化合物广泛存在于自然界，是一類重要的天然有机化合物，很多植物中都含有一定量的黄酮。黄酮种类很多，其主要类型有黄酮、异黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷醇等等，具有一定的保健和药用价值。黄酮类化合物的存在形式既有与糖结合成糖苷的，也有游离态，多呈黄色，在紫外光下一般具有荧光，具有很强的抗氧化性。紫外分光光度法是测定植物黄酮含量的主要方法，下面对具体的测定方法进行一些介绍，以供参考。
一直接测定法
黄酮是指具有 α或 β苯基苯稠吡喃酮的一类化合物，这种化合物的分子中含有肉桂酰基，也还有苯甲酰基，是一种综合的共轭体系，在甲醇溶液中，大多数黄酮类化合物在甲醇中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成。出现在300～400nm之间的吸收带称为带Ⅰ，出现在
240～280nm之间的吸收带称为带Ⅱ。带Ⅰ是由B环桂皮酰基系统的电子跃迁引起的吸收，而带Ⅱ是由A环苯甲酰基系统的电子跃迁引起的吸收，如图1所示。
峰带Ⅱ吸收紫外线的能力较强，也更适合直接测定法的检测。在利用直接测定法对植物含黄酮量进行测定时，需要运用lambert- Beer 定律进行计算。直接测定法主要利用了黄酮结构的特点，在测定的过程中不需要使用显色剂，在黄酮特征吸收峰处直接测定即可。这种方法比较直接快速，而且操作简单，但是也具有一定的缺点，只适合单一成分的测定，在检测的过程中，若样品含有一定杂质，可能会影响检测结果的准确性。应用这种方法对植物中的黄酮含量进行测定会存在一定误差，需求对样品进行严格的前处理，而前处理的过程多比较复杂，大大增加工作繁杂程度。直接测定法适用于实验条件比较差，并且检测用品比较缺乏的环境。
二显色测定法
黄酮类化合物多含有酚羟基而使其具有酸性，而γ-吡喃酮上的1-位氧原子上有未共用的电子对，使其表现出微弱碱性，可与强无机酸成盐，但极不稳定，遇水分解。显色测定法需要利用显色剂进行测定，其主要利用了黄酮化合物的这种特殊结构以及特性。常用的显色剂有硝酸铝、氯化铝等。Al3+可与黄酮分子中邻二酚羟基、3-羟基-4-羰基或5-羟基-4-羰基形成络合物，使带Ⅰ或带Ⅱ出现红移。与Al3+络合后，生成的络合物稳定性具有差异性，其与邻二酚羟基络合后，形成的络合物稳定性较差，在加入HCl等酸水后会分解，使相应的吸收带紫移。所以，根据黄酮的这种特性，可利用显色测定法对植物的黄酮含量进行测定，显色剂的选用主要依据显色后最大吸收波长处的吸收强度和稳定性，如使用硝酸铝显色，最大吸收波长在510nm附近，使用氯化铝显色，最大吸收波长在415nm附近。显色测定法的检测结果相对于直接检测法更加准确。
三差示测定法
测定植物中总黄酮含量一般直接用紫外光谱法测定，此法操作简单，时间短，但干扰较强，测定值往往偏高。这主要是由于叶类中草药中含有大量的叶绿素干扰测定，虽然有报道用石油醚处理样品可除去大量叶绿素，但由于中草药成分的复杂性，在黄酮类成分主要吸收范围内仍可能有其他成分产生吸收而干扰测定。也有使用大孔吸附树脂、聚酰胺柱层析或固相萃取等前处理方法排除干扰，但处理过程相对繁琐费时，又易引起成分损失。而差示分光光度法可以有效的解决这一问题，黄酮类成分与一些金属离子（如Al3+）形成络合物后，在特征吸收波长处吸光度值会发生显著变化，这种吸光度变化的差值与浓度在一定范围内呈线性关系，而样品中共存的其它干扰成分，由于不能与络合剂反应，在此波长处吸收性质不发生改变，因而对测定无影响，可较好解决背景吸收的问题。用示差分光光度法可以大大提高测量的精确性和再现性，可以回避杂质干扰，保证实验结果的准确性，是一种较简便的方法。植物原液中含有的成分很多，而这些成分的吸光性具有一定的差异，通过选择合适的络合试剂，就可以轻松测定植物中的黄酮含量。
四多波长法测定
多波长测定法是紫外分光光度法测定植物黄酮含量中最常用的方法，采用这种方法可以提高检测结果的准确性。下文主要介绍了双波以及三波长法。
1、双波长法测定
双波长分光光度法是在传统的单波长分光度法的基础上发展起来的。单波长分光光度法要求试样本身透明，不能有混浊，如果是试样溶液在测量过程中逐渐产生浑浊便无法正确测定。对于吸收峰相互重叠的组分或背景很深的试样分析，也很难得到准确的结果。双波长分光光度法的建立，在一定程度上克服了单波长法的局限性，扩展了分光光度法的应用范围，在选择性、灵敏度和测量精密度等方而都比单波长法有进一步的改善和提高。
在测定植物中的黄酮成分时，植物提取液中含有大量的原花色素、叶绿素，会产生严重的背景干扰， 强背景吸收会减弱黄酮的特征吸收峰， 若进行杂质分离又难免会损失黄酮含量， 降低测定准确度，而采用经典的分光光度法难以找到合适的参比溶液来消除其干扰。这种情况下，采用双波长分光光度法，将λ1选择在被测组分的最大吸收波长处，λ2的选择要使得干扰组分在λ1和λ2处的吸收度相同（如图2），这样可以从分析波长的信号中减去参比波长的信号，消除了干扰，大大提高了方法的选择性和灵敏度。
2、三波长法测定如果在干扰物的吸收光谱上找不到合適的等吸光度点，用一般分光光度计就难于进行双波长法测定，而用三波长法就可顺利完成测定。与普通双波长法相比， 三波长法在排除干扰、提高分析灵敏度及准确度方面更为优越。三波长光谱法的基本原理如图3所示。
在任一吸收曲线上，可以在任意选择的三个波长处测量吸光度。根据三角形和三角形相似，可推导出在上述三个波长处测量的吸收度具有下列函数关系：
DA值与待测物浓度成正比，因而可通过曲线求出样品中待测组分的含量。从上图可知，如选择的三个波长相应于吸收曲线上三点处于一条直线上，则测得的DA值为零。因此只要在干扰物质曲线上找到处在一条直线上的三点，在此三点相应的波长处测定，由于干扰物在此三波长处的值为零，故测得的值只与待测组分的浓度有关。
通常情况下，干扰组分的波形较为复杂，单峰波形比较普遍，这样很难找到在吸收曲线上处于一条直线上的三点，这时可引入“零点”作为第三波长点，即在吸收曲线的端点附近的基线上，选择一个波长点作为l3，如图4中的P点，它所对应的吸光度为零。从而使三波长法更具普遍性，可以消除任何峰形吸收曲线干扰组分的影响。
五结语
综上所述，紫外分光光度法测定植物黄酮含量的方法多种多样，而且测定结果的准确性具有一定的差异性，不同的方法测定的步骤不同，使用的实验溶剂以及测定环境也不同。直接测定法是最简单的测定方法，而且也不需要用到显色剂等化学溶液，但是采用这种方法的测定结果，存在一定的误差，植物提取液样品中可能含有杂质，需要对样品进行预处理，这就增加了实验的难度。对植物黄酮含量的测定多采用多波长法的测定方法，三波长法中的波长选择和计算比单波长法麻烦而费时，但测定的准确度、精密度比解联立方程组分析混合组分的方法高。随着计算机技术的发展，三波长法专用计算程序的出现，这些麻烦在日益减小，三波长法成为测定实验中常用的方法。本文介绍了紫外分光光度测定植物黄酮含量的几种方法，希望可以为相关研究人员提供更好的方法来进行黄酮的定量分析，为植物中黄酮成分的检测提供参考。
参考文献
[1]田燕.紫外-可见光谱在黄酮类鉴定中的应用[J].大连医科大学学报.2002（03）
[2]康旭珍.差示分光光度法测定桑叶总黄酮含量[J].光谱实验室.2005（03）
[3]王雷， 杨新建， 寇欣. 紫外分光光度法在中药分析中的应用进展[J].天津药学， 2003
