乳酸菌用作口服疫苗表达载体的应用研究进展亓秀晔;刘乃芝;程福亮;徐海燕;谷巍【摘要】乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌,被公认为绿色安全级微生物,可以在机体内粘附、定植和复制,益生作用和免疫原性使其成为最有前景的活菌载体.利用基因工程手段插入外源基因制备重组乳酸菌口服疫苗,能够持续刺激机体分泌特异性抗原蛋白,多个基因的插入甚至能达到一免治多病的目的.口服免疫效果优于注射免疫,治疗成本也大大降低.该文论述了乳酸菌活载体疫苗的优势,对乳酸菌表达载体在动物疫病防控及代谢产物调控上的应用等方面的研究进行综述,并对其应用前景进行分析和展望.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2019(038)006【总页数】6页(P18-23)【关键词】乳酸菌;口服疫苗;表达载体;动物疫病【作者】亓秀晔;刘乃芝;程福亮;徐海燕;谷巍【作者单位】山东宝来利来生物工程股份有限公司山东省动物微生态制剂省级重点实验室,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司山东省动物微生态制剂省级重点实验室,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司山东省动物微生态制剂省级重点实验室,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司山东省动物微生态制剂省级重点实验室,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司山东省动物微生态制剂省级重点实验室,山东泰安271000【正文语种】中文【中图分类】TS201.1疫苗是用病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法，制成的用于预防传染病的自动免疫制剂[1]。
作为关乎人民群众健康、公共卫生安全及国家安全的特殊产品，接种疫苗在整个人类社会安全中起着重要作用。
活载体疫苗（live vector vaccine，LVV）是通过分子生物学手段将有效的目的抗原编码基因导入活载体（无或弱毒的细菌或病毒），从而构建重组菌（毒）株，使目的基因随着重组菌（毒）株在宿主体内的增殖而大量表达，从而诱发相应的免疫保护应答，是目前最具发展潜力的新型基因工程疫苗之一[2]。
活载体疫苗可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，进而激发全身的黏膜免疫，具有特异性强、免疫效果持续稳定、诱导位点专一、免疫方式简单等优点，而且如果载体中同时插入多个不同病原的外源基因，就能实现一免防多病的目的，这都是传统疫苗无法比拟的优势。
乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是在人体、动物、植物和整个自然界中广泛分布的并公认的绿色安全级（generally regarded as safe，GRAS）微生物，是一群能大量发酵碳水化合物并产生乳酸的革兰氏阳性细菌，分属十几个。
LAB主要通过在机体肠道内定植来改善肠道微生态环境，并具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏等益生作用及免疫调节等生理功效[3]。
从21世纪初开始，国内外学者就开始致力于对LAB分子生物学及作用机制的研究，以乳球菌（乳球菌、粪链球菌等）、乳杆菌（干酪乳杆菌、植物乳杆菌、拉曼乳杆菌、嗜酸乳杆菌等）和双歧杆菌（长双歧杆菌、金双歧杆菌等）等作为基因工程受体菌，应用基因工程技术有目的、有选择地研制新型微生态制剂，以更好的控制其益生性状和免疫效果[4-5]。
研究表明，像抗原、酶类、细胞因子、抗体、过敏原蛋白等一系列外源蛋白分子均可以在LAB中重组表达[6]。
黏膜免疫的接种方式也是影响免疫效果的关键因素，消化道口服免疫和鼻腔免疫是目前重组乳酸菌疫苗使用最为广泛的黏膜免疫方式，至于两种免疫方式的效果比较目前还没有定论[7-8]，但是两种方式都可以通过胃肠黏膜进行抗原递呈，经不同的免疫通路产生与常规注射类似的免疫反应而产生的副作用远小于后者，动物实验和人体临床实验也验证了基因工程LAB对于多种疾病预防和治疗的有效性。
1 LAB用作口服疫苗活菌载体的优势LAB作为外源基因表达宿主菌，其优越性主要表现在：（1）培养容易，操作方法（如电穿孔法转基因）简便，技术成熟，副作用少，成本低；（2）LAB作为GRAS益生菌，可直接口服，比一些减毒的载体更具有安全性，同时免去了目的蛋白的体外提纯等后续加工处理工序。
LAB在发挥自身益生功能的同时，增强免疫效果，一举多得；（3）重组的LAB可用来表达不同类型的异源蛋白，比如嵌合的或非嵌合的抗原、细胞因子、各种酶等，同时还能将具有多种功能的药物分子串联表达，达到一免治多病的效果[9-11]；（4）可在细胞内表达也可在细胞表面表达和分泌到胞外[12]；（5）LAB对机体黏膜有极强的粘附作用，因此进入消化道、呼吸道、泌尿系统等在黏膜处不断繁殖，持续向机体释放特异性的目的抗原蛋白[13]；（6）具有免疫佐剂作用、固有免疫原性及对胆汁酸的抵抗力，不需要额外地提供外源性抗原刺激动物机体就能发生黏膜免疫和系统免疫[14-15]。
因此，LAB作为基因工程受体菌的应用前景十分广阔。
2 LAB应用于活载体疫苗的研究2.1 LAB载体分类及表达调控元件许多LAB都被发现了质粒的存在，且数量各异，1个或多个。
脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）杂交和核苷酸序列分析证实，小质粒同其他革兰氏阳性菌的线性质粒具有不同程度的同源性，一些LAB复制子宿主范围广泛，质粒间可以进行频繁的横向传递和重组，因而可在其他种类的革兰氏阳性菌及大肠杆菌中穿梭表达；此外，LAB质粒多为滚环复制，质粒分离相对稳定，可在宿主体内持续稳定的表达蛋白，LAB质粒的这些特点有助于其在宿主体内进行基因克隆和蛋白表达，因此，了解LAB的质粒载体系统是研究基因工程乳酸菌的首要步骤。
（1）克隆载体：LAB中研究的第一个克隆载体的构建是在2个广宿主范围的复制子pWV01和pSH71的基础上发展起来的，后又逐渐衍生出许多新的质粒；另外一个广泛应用的复制子是从粪肠球菌中分离出的pAMbeta-1质粒，后又衍生出pIL252和pIL253[16]质粒。
（2）表达载体：根据表达载体启动子类型的不同，LAB表达载体可分为两种类型：诱导型表达载体和组成型表达载体。
目前应用最广泛的诱导型表达系统是乳链菌肽受控的表达（nisin-controlled expression，NICE）系统，是由乳链菌肽nisin控制的食品级高效诱导表达系统，缺点是需要在免疫重组菌株之前提前诱导才会获得高质量的蛋白表达[17]，如ENOUF V等[18]用NICE系统表达产生轮状病毒非结构蛋白4（rNSP4），可产生具有抗原和免疫原特性的rNSP4蛋白，且与病毒蛋白有相同的免疫原特性。
组成型表达系统能够持续稳定的表达目的蛋白，不需要提前诱导，如从LAB中分离的组成型启动子P32、P59和P23己成功地用于pMG76e、PVE5523和pOri23等组成型载体的构建[19]，如JEONG D W等[20]以pMG36e载体为基础，使用来自于植物乳杆菌的半乳糖苷酶基因替代红霉素抗性标记基因，成功的在乳酸乳球菌中构建了分泌性表达载体。
相对而言，乳杆菌的表达载体由于遗传多样性等问题发展较缓慢，常用的乳杆菌的载体有pWV01、pSH71和pAMbeta-1等[21]。
乳杆菌的表达载体同样包括组成型启动子如Ppgm、Pldhl、Ps1pA和诱导型启动子[22]。
2.2 LAB表达载体调控元件的选择性标记LAB表达载体的调控元件即质粒上都带有一个或多个特定的选择性标记基因。
LAB 选择性标记主要分为两类：非食品级标记和食品级标记。
非食品级标记一般为常见的抗性筛选标记基因（如红霉素、氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素等抗性基因），可选择在加有这些抗生素的培养基里进行抗性压力筛选，然而在全人类无抗时代，抗性基因的携带易造成潜在危害。
随着人们对食品安全问题日益重视，众多学者一直致力于高效、无毒副作用的食品级表达载体的研究。
常用的食品级表达载体主要有：糖诱导表达载体、噬菌体Φ31爆发式诱导的表达系载体、乳链球菌素调控表达载体、pH值调控表达载体等，这类表达系统的基因载体、受体及诱导物均为食品安全级，可直接口服免疫。
2.3 LAB表达载体的应用2.3.1 LAB表达载体在动物疫病防控上的应用做好动物疫病防控工作意义重大，关乎全人类健康和福利。
流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，传播速度快，易造成人畜共患病，危害较大。
流感病毒分为甲、乙、丙3种类型，其中甲型流感病毒极易变异，可引起反复流行或大流行，20世纪几次著名的流感大流行均由甲型流感病毒引起[22]。
甲型流感病毒的宿主范围非常广泛，它可以感染禽类、猪、马、狗、海洋生物、哺乳动物和人类等，甲型流感病毒可以分为16种血凝素（hemagglutinin，HA）亚型（H1～H16）以及9种神经氨酸酶（neuraminidase，NA）亚型（N1～N9）[23]，各亚型在宿主之间有一定局限性。
其中猪流感（swine influenza，SI）的病原是猪流感病毒（swine influenza virus，SIV），属于正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒[24]。
目前没有正规的SI的疫苗，预防困难，从分子方面着手是有效的措施。
M2e是SI基质蛋白M2胞外域的保守序列，包含24个氨基酸，M2e蛋白被认为可刺激机体产生免疫反应来应对多种流感病毒亚型的保护性抗原[25]。
王倩[26]将植物乳酸菌NC8作为外源蛋白的递送载体，将SIV主要保护性抗原M2e蛋白基因与小鼠的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的Fc受体片段基因融合在一起，成功制备了含有pSIP409-3M2e-Fc的重组乳酸菌口服疫苗，并发现重组口服疫苗对小鼠有显著的免疫效果（P＜0.05）。
NS1蛋白是SIV基因组中唯一的非结构蛋白，保守性较高，具有可以加快病毒复制，扰乱宿主免疫系统的作用，并且由于其结构的独特性可以用来到区分感染动物和免疫动物。
YANG WT等[27]通过将NS1基因与穿梭载体相连构建重组质粒pSIP409-pgsA-NS1并导入植物乳酸菌NC8，成功构建了新型功能乳酸菌口服疫苗，此款口服疫苗能提高感染SI病毒小鼠的存活率，对甲型流感病毒（H1N1）型SIV有一定的保护作用。
这为SI的防治提供了有力证据。
禽流感（avian influenza，AI）的病原是禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）。
目前常用的防控AI有效的途径是疫苗，但由于AIV抗原容易变异易导致疫苗防控存在局限性，影响了疫苗的免疫效果。
HA是AIV的血凝素，具有强烈的抗原性，HA2在AIV的各个亚型之间是相对保守的，是制备通用型疫苗的候选抗原。
YOON A W等[28]进一步利用pgs A蛋白将HPV-16衣壳蛋白L2于干酪乳杆菌（L.casei）表面进行展示，证实该菌株除了能介导机体产生全面的免疫应答以外还能对多种其他亚型的乳头瘤状病毒产生交叉中和反应。
