双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-1

实验设备
双向电泳是目前为止最有效、使用最多的蛋白分离方法。差异蛋白质组学是在双向电泳后用考麻斯亮蓝、银离子或荧光染料等将蛋白斑点染色，然后比较差异。本公司在各类微生物、培养细胞、动植物组织（如动物软硬组织、体液、植物种子、叶子等）、亚细胞组分的双向电泳分离及后续质谱鉴定中均有丰富的经验。
一、蛋白质组学双向电泳技术服务项目：
1.根据客户需求定制蛋白质组学实验方案
2.各种规格胶条长度的双向电泳
3.考麻斯亮蓝染色、银离子染色；
4.DIGE系统双向电泳。
5.图像分析
6.切胶质谱分析
二、说明
1.蛋白质组学实验的总体实验流程；
双向电泳结果提交
A：实验的试剂耗材、仪器设备、操作过程一份；
B:实验结果凝胶扫描图片；
C：电泳凝胶（可收费干胶）；
D：剩余样本。
说明：
1.样品制备指可用通常程序处理的原样，如样品较特殊（需要去除核酸、盐等杂质或需要浓缩），价格将视进一步处理的难度和耗材用量另行商定；
2.建议客户提供的原样（组织、细胞、菌体等）湿重不少于100mg,如直接提供蛋白提取物，则浓度不少于4ug/ul，总量不少于5mg;
3.样品的还原和烷基化过程一般在制备时进行；
蛋白双向(2-D)电泳实验服务
实验技术简介：双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。[晶莱生物]
测序实验流程：
4.图象处理与切胶主要是手工操作成本。
实验介绍：
双向电泳将等电聚焦电泳和SDS-PAGE相结合，即先进行等电聚焦电泳，然后再进行SDS-PAGE，经染色得到二维分布的蛋白质图谱。

双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景1 双向电泳技术1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。

双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。

双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。

双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。

双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。

可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。

就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。

1.2 双向电泳技术的原理双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一。

它利用了各种蛋白质等电点和分子量的不同来分离复杂蛋白质组分，具有较高的分辨率和灵敏度，目前已成为复杂蛋白质组分检测和分析的最好的生化技术。

IPG - DALT系统双向电泳技术原理简明：首先利用等电聚焦( isoelectric focusing ,IEF) 将蛋白质沿pH 梯度分离至各自等电点(isoelectric point ,pI)，通过电荷分离蛋白质；然后沿垂直的方向以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( sodium dodecyl sulphate polyacryla -mide gel electrophoresis ,SDS-PAGE)，通过分子量分离蛋白质。

所得蛋白双维排列图中每个点代表样本中一个或数个蛋白质，而蛋白质的等电点、分子量和在样本中的含量也可显现出来。

制备原则：
由于双向电泳所分析样品的多样性，没有一种通用的制备方法 适用于各种样品。但有几条共同的原则需要遵循
（1）尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的非共价键结合， 使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在
（2）避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用 （3）避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用 （4）蛋白质样品与第一向电泳的相容性。
双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：
(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调 节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望 的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上， 但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。
(2)极酸或极碱蛋白的分离。 (3)极大（＞200kD）或极小（＜10kD＝蛋白的分离。 (4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白 (5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切
双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，其
分辨率已从15个蛋白质点发展到10000多个蛋白质点。一 般的双向电泳也能分辨1000-3000个蛋白质点。因此，双 向电泳被广泛应用与农业，医学等研究领域。
由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重 要性质，而2DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差 异分离蛋白质，因此2DE的分离能力非常强大，它甚至能 将细胞中5000种蛋白分离开，2DE 在分离蛋白混合样品， 比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查 明大型蛋白复合物各组组分，与其他生物技术如分子生物 学，分子遗传工程，免疫学，微量蛋白质的自动氨基酸序 列分析相结合，可以快速准确的 发现和鉴定新的蛋白质。
聚焦完成后，胶条既可以在中间电压500-1000V下短时 间保持，便于随时进行第二向的平衡，也可以置于-80℃ 冰箱中进行长期保存。

双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。

本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。

同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。

关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。

双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。

双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。

双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。

双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。

可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。

就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。

1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。

双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。

第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。

在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。

双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。

因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。

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3.等电聚焦
等电聚焦的方法如上一章。由于双向电泳用的第 一向凝胶和样品中含有尿素和去污剂，聚焦时的温度 应稍高于通常用的温度，如15-20℃，以防止尿素结 晶。如在凝胶上覆盖一层膜，也可防治尿素结晶，并 克服二氧化碳的影响。由于尿素使蛋白变性，会增加 蛋白质的分子直径。鉴于以上一些原因，应适当的降 低电压和增加聚焦时间。
注：
① 根据样品溶解的需要，尿素浓度可增加至9-9.8mol/L。 ② 可用Triton X-100、 NP-40等非离子或两性离子去污剂代替CHAPS. ③ DTT必须在使用前加. ④ 裂解液最好在使用前配置，如有多余应分装，在-20℃保存。 ⑥ PMSF可替代
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2. IPG凝胶干胶条的再水化（泡胀）
为了样品等电聚焦的需要，作为双向电泳第一向的固相PH梯 度凝胶条中必须含尿素，去污剂，还原剂，载体两性电解质等， 不能长期保存，所以干胶条必须用含有这些成分的水化溶液重新 泡胀。
将在-20℃保存的IPG干胶条在室温下平衡一段时间后，用新 鲜配置的泡胀液重新在模具中泡胀过夜。
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IPG4-7
IPG4-7
IPG5-6
From Görg
IPG5.5-6.7
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Bioinformatics, 2008-2009, Shanxi Agricultural University

蛋白质谱（Proteomic spectrum）是指对蛋白质进行分离、鉴定和定量分析的一种技术手段。

蛋白质谱技术主要包括双向电泳（Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）、质谱法（Mass spectrometry，MS）等。

通过蛋白质谱技术，研究人员可以研究细胞、组织或生物体中的蛋白质组成和表达差异，从而揭示生物学过程中的分子机制。

蛋白质谱的主要步骤如下：
1. 蛋白质分离：将样品中的蛋白质分离出来，通常采用双向电泳技术。

双向电泳是将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，然后将凝胶中的蛋白质进行染色和扫描，获得蛋白质的分布情况。

2. 蛋白质鉴定：对分离出的蛋白质进行质谱分析，将蛋白质分解成肽段，并通过质谱仪检测肽段的质量。

质谱法包括多种技术，如矩阵辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-TOF MS）、电喷雾质谱（ESI-MS）等。

3. 蛋白质定量：通过质谱法检测蛋白质的相对含量。

质谱法可以准确地测定蛋白质的质量，从而实现对蛋白质的定量分析。

4. 数据处理与分析：将实验数据进行处理和分析，获得蛋白质的表达量、序列信息等。

研究人员可以利用生物信息学工具对数据进行挖掘，寻找蛋白质之间的功能关联和调控关系。

蛋白质谱技术在生物学、医学等领域具有广泛的应用价值，可以帮助研究人员深入了解生命过程中的分子机制，为疾病诊断、治疗和预防提供新的思路。

此外，蛋白质谱技术在药物研发、生物工程、食品安全等领域也具有重要应用前景。

【最新】电泳分离蛋白质电泳分离蛋白质是一种常用的生物化学技术，它利用蛋白质带电性质和分子大小的差异，将不同蛋白质分离出来。

下面是电泳分离蛋白质的最新技术和应用方面的详细介绍。

一、电泳分离蛋白质的基本原理电泳是在电场作用下，带电粒子在溶液中的迁移运动。

由于蛋白质具有带电性质，因此它们在电场中会发生迁移运动。

不同蛋白质的带电量和分子量不同，因此在电场中的迁移速度也不同。

通过控制电场强度和迁移时间，可以将不同蛋白质分离出来。

二、最新技术进展1.双向电泳（Two-Dimensional Electrophoresis）双向电泳是一种将等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合的电泳技术。

它可以将蛋白质分离成多个斑点，并利用计算机图像处理技术进行定性和定量分析。

双向电泳可以用于比较不同样品之间蛋白质表达谱的变化，以及寻找疾病生物标志物等。

2.全蛋白质组学研究（Proteome Research）全蛋白质组学研究是一种对细胞、组织或生物体中所有蛋白质进行系统研究的学科。

它涉及到蛋白质分离、鉴定、定量和功能分析等方面。

利用双向电泳技术和质谱技术，可以系统地分离和鉴定细胞中的蛋白质，为全蛋白质组学研究提供有力支持。

3.微流控芯片技术（Microfluidic Chip Technology）微流控芯片技术是一种将生化分析过程集成在微米尺度芯片上的技术。

它具有高效、快速、自动化和微型化等优点，可以用于蛋白质分离、鉴定和检测等方面。

利用微流控芯片技术，可以实现在单细胞水平上对蛋白质进行检测和分析，为生命科学和医学研究提供有力支持。

三、应用领域1.疾病诊断与治疗利用电泳分离蛋白质技术，可以分离和鉴定疾病相关蛋白质，为疾病诊断和治疗提供有力支持。

例如，通过比较健康人和患者的血清蛋白谱，可以寻找疾病特异性标志物，为疾病诊断和治疗提供指导。

2.药物筛选与研发利用电泳分离蛋白质技术，可以分离和鉴定药物作用靶点，为药物筛选和研发提供有力支持。

双向凝胶电泳技术原理与应用Principle and application of two-dimensional gelelectrophoresis姓名：XX班级：检查本科1113班学号：XXX【摘要】人类基因组筹划与美国塞莱拉遗传信息公司于在美国《科学》杂志和英国《自然》杂志联合宣布，她们绘制出了精确、清晰、完整人类基因组图谱，至此，人类基因组筹划已基本完毕，随着后基因组时代到来，蛋白质组学得到了空前发展，蛋白质组研究旨在揭示基因表达真正执行生命活动所有蛋白质表达规律和生物功能。

涉及蛋白质组、蛋白质组学、功能蛋白质组学和构造基因组学等新概念提出，蛋白质组学已成为当今生物领域中极其活跃学科。

其中双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2.DE）是蛋白质组研究三大核心核心技术之一【abstract】Human gene group plans and United States sailaila genetic information company Yu in United States Science under magazine and United Kingdom natural under magazine joint announced，they draws out has accurate，and clear，and complete of human gene Group map，at this point，human gene group plans has basic completed，as Hou gene group era of comes，protein group learn get has unprecedented of development，protein group research aimed at reveals gene express of real implementation life activities of all protein of express law and biological function. Includes proteome，proteomics，structural proteomics and functional genomics of new concepts，such as proposed，proteomics has become extremely activein the field of biological sciences. Two-dimensional gel electrophoresis (two-dimensional electrophoresis,2.DE) is one of the three key core technologies of proteome research【核心词】双向电泳；蛋白质组学；后基因组时代【 key words 】two-dimensional electrophoresis，2.DE proteomics Post-genomics era【前言】由于蛋白质等电点和分子量是两个彼此不有关重要性质，而2.DE同步运用了蛋白质间这两个性质上差别分离蛋白质，因而2.DE分离能力非常强大，它甚至能将细胞中5000种蛋白分离开，2.DE在分离蛋白混合样品、比较差别方面有不可代替作用，结合质谱鉴定技术可查明大型蛋白复合物各组组分，与其她生物技术如分子生物学、分子遗传工程、免疫学、微量蛋白质自动氨基酸序列分析相结合，可以迅速精确地发现和鉴定新蛋白质。

它带电荷的性质，具有不同pI的两性电解质在同一环境中带有不同 性质和数量的电荷，
另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：
H2O
H++OH－
使溶液的pH有所改变。当某一两性电解质的pI较低，即释
放质子（ H+ ）能力较强，使溶液 pH 值下降，这类两性电
解质称为酸性两性电解质；而pI高的两性电解质可使溶液
1.2.1组合摸式：双向电泳主要是电荷分离——分子质量分 离的组合摸式。 （ 1 ）第一向为电荷分离：通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 毛细管电泳将样品按蛋白质等电点的差异进行分离。 （ 2 ）第二向为质量分离：通过 SDS— 聚丙稀酰胺凝胶电 泳按相对分子质量大小不同进行分离。
1.2.2分类：双向电泳根据其第一向使用的介质的不同可以
们到达净电荷为零的位置时才停止。
具有最低和最高等电点的分子带电荷最多，泳动速度最快， 所以pI梯度的形成开始在正、负级两端，然后不同pI的载 体两性电解质分子逐渐到达它们自己的等电点位置而形成
一个连续的pI梯度。如图所示。
A
B
C
载体两性电解质在电场中形成pI梯度的模式图
A 原始状态 B pI梯度的形成过程 C连续pI梯度的形成
出的优点。
图 等电聚焦的“聚焦效应”
等电聚焦电泳根据蛋白质等电点不同而将其分离，也可以根据蛋白 条带在pH梯度中形成的位置测定其等电点。
3第二向电泳——SDS电泳的基本原理
3.1蛋白质-SDS复合物
(1)SDS的作用：SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中
以单体和分子团(micellae)的混合形式存在，作为一种变性
中存在三个物理效应和四个不连续性的分离系统。
3.2.1三个物理效应

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利用双向电泳可以分辩出5000—10000个蛋白质组 分
分离得到的蛋白质组分纯度达到90%以上，可以 稳定地保存在凝胶上
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注意
双向电泳分离的结果使蛋白质点而不是条带。 根据
Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子
质量的增加。
PI增加
分 子 质 量 增 加
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Thank You For Watching
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蛋白质双向电泳技术
—— 基本原理
2020/12/09
姓 名：郭吉星 学 号：2010103024 任课老师：祝建波 教授

双向电泳 技术
双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE） 是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取 的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数 千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分 辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分 离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图 像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称 为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
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第二向SDS-PAGE
SDS-PAGE是利用SDS使蛋白质变性，多肽链 变成长棒状，不同长短肽链间短轴基本相等，长 轴长度与肽链长度成正比。SDS与蛋白质形成复 合物，并且按1.4gSDS与1g蛋白质等比例结合（相 当于两个氨基酸残基结合一分子的SDS）使之带 上大量负电荷
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双向电泳技术
第一向按蛋白质等电点的不同，每个蛋白质分子 沿pH梯度迁移至与其等电点相等的位置

双向电泳双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE 的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

蛋白质组研究蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加］. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失］. 此外，低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战. 亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1～15 mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点. 由于碱性pH 范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.蛋白质组研究蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加］. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失］. 此外，低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战. 亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1～15 mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点. 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.2-DE面临的挑战2-DE面临的挑战是高分辨率和重复性. 高分辨率确保蛋白最大程度的分离，高重复性允许进行凝胶间配比(match). 对2-DE而言，有3种方法分离蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技术为基础. 第一向应用载体两性电解质(carrier ampholyte, CA)，在管胶内建立pH梯度. 随着聚焦时间的延长，pH梯度不稳，易产生阴极漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分离碱性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦达到平衡状态，碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失. 因此，在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成，但很难控制. 3)IPG-DALT 发展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出现解决了pH梯度不稳的问题. IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度，克服了IEF的缺点，从而达到高度的重复性. 目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线，范围或宽或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3～5或碱性pH 6～11的IPG凝胶梯度联合商品化的pH 4～7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群(proteomic contigs)从而有效分离.分离后的斑点检测分离后的斑点检测(spot detection)亦很重要. 所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术. 银染已成为一种检测2-DE的流行方法，可检测少到2～5ng的蛋白，因此较考马斯亮蓝R-250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，一些有机染料不适于PVDF膜. 放射性标记不依赖其代谢的活性，并仅适于对合成的蛋白质检测. 另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳)，即应用两种不同的染料荧光标记两个样品，使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个，避免了几种2-DE的比较，可在纳克级进行检测.较早期相比，2-DE有两个主要的进步：首先，极高的重复性使有机体的参考图谱，可通过Internet获得，来比较不同组织类型、不同状态的基因表达；其次，高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.常见问题及其解答重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D 的一向吗？一般情况下是可以的。

双向电泳技术研究进展摘要：双向电泳(two dimensional electrophoresis , 2-DE)技术是获得细胞、组织或器官等蛋白表达图谱的主要手段，是蛋白质组学研究的三大核心技术之一。

本文主要从双向电泳技术的发展，主要操作步骤及其面临的主要挑战等方面对改技术的研究进展进行综述。

关键词：双向电泳；研究1.双向电泳技术的发展蛋白质双向电泳源于1975年O,Farrell. Klose.Scheele 对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究。

它首先根据样品中蛋白质等电点不同进行等电聚焦(IEF)作为第l向，然后再按照蛋白质分子量大小不同进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE)作为第2向，经染色后可以在凝胶上得到大量的蛋白质点，从而得到样品的蛋白质表达图谱。

根据双向电泳中第l向等电聚焦方法的不同，双向电泳主要分为2个主要类型，ISO-DALT(等电点一道尔顿)IPG．DALT ( 固相pH梯度一道尔顿)双向电泳。

1.1 ISO-DALT双向电泳技术传统的ISO-DALT双向电泳中，首先将载体两性电解质添加在丙烯酰胺凝胶中，凝胶聚合后在电场作用下形成连续的DH值梯度，两性电解质以游离的形式分布于聚丙烯酰胺凝胶的网孔中。

通常采用圆柱状电泳，IEF凝胶制备在圆柱型玻璃管中，可以将样品加在未凝固的凝胶溶液中，也可在凝胶凝固后在玻璃管顶端加样，然后进行等电聚焦，通常在50～100V电压下聚焦1～2 h，让样品进入IEF胶条，然后在200 ～400V或更高电压下进行聚焦，直到电流接近零时为止。

等电聚焦结束后取下凝胶柱，向玻璃管中凝胶与管壁间注水，将凝胶条吹出，用缓冲液平衡凝胶条，主要目的是充分打断多肽链间及多肽链内部的二硫键并使其与SDS充分结合，然后将胶条用琼脂包埋于第2向电泳的凝胶板中，进行第2向SDS-PAGE，SDS-PAGE 可以使用均一的分离胶浓度，也可采用不连续梯度胶或者连续梯度胶。

双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。

本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。

原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。

在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。

通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。

双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。

等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。

在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。

通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。

2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。

在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。

由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。

因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。

3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。

常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。

对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。

染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。

通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。

步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。

常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。

2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。

免疫共沉淀和双向电泳是生物化学和分子生物学领域中常用的两种实验技术，用于研究蛋白质相互作用、表达水平和特性等。

免疫共沉淀（Immunoprecipitation）：免疫共沉淀是一种用于检测蛋白质与其它蛋白质、DNA或RNA相互作用的技术。

基本原理是利用抗体的高度特异性，将感兴趣的蛋白质与其相互作用的分子特异地沉淀下来，然后通过分析沉淀物来揭示蛋白质间的相互作用关系。

免疫共沉淀的步骤：1. 抗体固定：将特异性抗体固定在磁珠、琼脂糖或其他固相载体上，形成“免疫复合物”。

2. 样品处理：将含有目标蛋白质的样品与免疫复合物进行孵育，使抗体与目标蛋白质结合。

3. 洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除非特异性结合的物质。

4. 沉淀：用适当的方法，如磁珠分离或离心，将免疫复合物沉淀下来。

5. 分析：分析沉淀物中是否存在与目标蛋白质相互作用的分子，可以使用Western blot、质谱等方法。

双向电泳（Two-Dimensional Electrophoresis，2DE）：双向电泳是一种用于分离复杂蛋白质混合物中蛋白质的方法，通过结合两种不同的电泳技术，能够在两个维度上进行分离，从而实现更高分辨率的蛋白质分析。

双向电泳的步骤：1. 等电聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）：在第一个维度中，蛋白质在电场的作用下沿着等电点移动，根据其等电点进行分离。

等电聚焦是根据蛋白质的电荷性质进行分离。

2. SDS-PAGE：在第二个维度中，将IEF分离的蛋白质在SDS-PAGE凝胶中进一步分离，根据分子质量进行分离。

3. 染色和分析：通过染色方法（如银染色、荧光染色等）将分离的蛋白质可视化，然后进行分析和鉴定。

双向电泳可以提供较高的分辨率，能够分离出更多的蛋白质，从而对样品中的蛋白质组成进行更全面的分析。

这些技术在生物医学研究、药物开发、生物标记物鉴定等领域中有广泛的应用，有助于深入了解蛋白质相互作用、表达水平以及功能等方面的信息。

对重组表达蛋白的初步鉴定 将一维电泳和生物质谱相结合，达到对较简 单蛋白复合物的分离和鉴定
一维电泳在蛋白质组研究中的 应用举例
我们将一维电泳和LC-Ms/MS结合，成功进行如
下研究：
(1)血浆蛋白质组研究
(2)SARS病毒蛋白的分析鉴定,成功鉴定了SARS病
毒的S蛋白、N蛋白和E蛋白，有力推动了我国第
离，去除干扰。此外，也证明该系统对脂多糖和
脂寡糖混合物的分离有效。
12%胶常用的低分子量标准蛋白
名称 磷酸化酶B 牛血清白蛋白 卵清蛋白 碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 溶菌酶 来源 兔肌肉 牛 鸡蛋清 牛 大豆 鸡蛋清 分子量 97400 66200 45000 31000 21500 14400
一维凝胶染色
Initially solubilized in 0.5-1% SDS,followed by dilution with at least an eight excess of 2-4% (w/v) NP40, Triton X-100, or CHAPS to reduce the final concentration to <0.25%. This dilution displaces the SDS from the proteins and replaces it with a nonionic or zwitterionic detergent.
对于脂蛋白，膜蛋白的分析， 可以用如下的蛋白质裂解液： 7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 40 mM Tris base, 65 mMDTE
Presulubilization of protein in (boiling) SDS buffer, followed by dilution with urea lysis buffer.

(4)c. 图像分析及数据处理(3)经活检及病理证实，有 12 条为扩张型心肌病特有的蛋白。

(6)RA 和 OA ：类风湿关节炎 (RA) 是一种常见的慢性炎性关节疾病，本病侵犯多个关节，主要累及手足小关节，病情迁延反复，主要的病理变化为关节滑膜的慢性炎症，细胞侵润，血管翳形成，软骨及骨组织侵蚀，导致关节结构的破坏，功能丧失。

而骨性关节炎 (OA) 其基本病理改变为多种致病因素引起的进行性关节软骨变性，破坏及丧失，关节软骨及软骨下骨边缘骨赘形成，由此引起一系列的关节症状和体征。

有研究者对滑膜细胞进行原代培养，应用流式细胞仪鉴定滑膜细胞类型，提取蛋白进行双向电泳分离，比较 RA 与 OA 成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-Like Syno-viocytes ， FLS) 蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异，结果显示： RAFLS 蛋白酪氨酸磷酸化较 OAFLS 明显增多，其中以相对分子质量 42 × 10 3 ~95 × 10 3 间蛋白酪氨酸磷酸化位点居多，对其结果进行灰度扫描， RAFLS 灰度扫描值为 4227672 ± 8947 ，OAFLS 为 663480 ± 7962 ， RAFLS 的灰度扫描值约为 OAFLS 的 6.5倍，两者具有非常显著性差异 (T= 2.820 ， P<0.01) 。

1980 年 Hunter 首先发现酪氨酸激酶 (PTK) ，许多生长因子受体都具有 PTK 活性，一半以上的癌基因产物也具有 PTK 活性，他发现酪氨酸磷酸化比例虽小，但却与细胞生长、增殖关系密切，很可能是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键，癌基因活化后， PTK 活性大大增加。

1992 年，Williams 等研究发现， RA 滑膜细胞中的 PTK 活性远远高于 OA ，这可能是导致 RA 滑膜细胞转化特性而呈持续活化状态的关键，作者推测RAFLS 可能存在原癌基因的活化或突变，或多种生长因子受体的持续激活，从而导致转化细胞的外观表现并伴有 PTK 活性的增高。

双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。

双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。

2D 电泳优越性●对未处理样本耐受性好●不需要预纯化(如：色谱层析)●分辨率非常高●2D 可以有效的组分收集器●蛋白在凝胶介质中受到保护●在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ）●与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多●与后续分析技术兼容性好一、基本原理：先将蛋白质根据其等电点在pH梯度胶内（载体两性电解质pH梯度或固相pH 梯度）进行等电聚焦，即按照它们等电点的不同进行分离。

然后按照它们的相对分子质量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离。

样品中的蛋白经过等点电和分子质量的两次分离后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量等信息。

值得注意的是，双向电泳分离的结果使蛋白质点而不是条带。

根据Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子质量的增加。

第一向：等电聚焦1．[基本原理]从电泳观点看，蛋白质最主要的特征是它的带电行为。

蛋白质是由20种不同的氨基酸按不同比例通过肽键的连接构成的。

由于蛋白质的一些氨基酸侧链在一定的pH值的溶液中是可解离的，从而带有一定的电荷。

构成蛋白质的所有氨基酸残基上所带正负电荷的总和便是蛋白质所带的净电荷。

蛋白质在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，在低pH时，蛋白质的净电荷是正的，在高pH时，其净电荷是负的，但在某一pH时，它的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoelectric pointpI）。

蛋白质的等电点值取决于其氨基酸的组成，是一个物理化学常数。