自制冷冻叶玻璃化冷冻小鼠自然周期及超排卵周期卵母细胞的研究

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冷冻载体对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻效果影响的研究

义（Ｐ＜００）Ｄ组与其他３卵母细胞冷冻保存后卵子复苏率、胎受精率、续发育潜能的比较，异无统计学．１；组胚继差
４种玻璃化冷冻载体都是小鼠卵母细胞快速玻璃化冷冻保存中可行的冷冻载体，自制叶
片组的卵子回收率明显低于其他３组，更进一步熟练叶片制作的技术和实验人员操作技能。需
宁夏医学杂志２１０１年９月第３３卷第９期
Ｎｎｘｅ，ｅ．０１Ｖｌ３。ｏ９ｉｇｉＭｄＪＳｐ２１，ｏ３Ｎ．ａ
文章编号：０ — ９９２１） —８６０１１５４（０１０００ —３０９
・论
著・
冷冻载体对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻效果影响的研究
自从Ｗｈｔｎｈｍ等（９２和Ｗｉｕ（９２ｉｉａｔｇ１７）ｌｔ１７）ｍ首次报道冷冻一解冻小鼠胚胎成功以来，采用快速玻
璃化冷冻法冷冻小鼠卵母细胞，给人类卵子的冷冻提
周昆明雄性小鼠共３０只（自宁夏医科大学动物实购
验中心，普通级）。
１２仪器：视显微镜（６．体ＳＥ标准型，ｌｐｓＪ— Ｏｙｕ，ａｍｐｎ、ａ）倒置显微镜（Ｘ１Ｊｐｎ及显微注射操作仪Ｃ２，ａａ）
（ＩＧｒａ）Ｃ２培养箱（ａｏｃ，２０ＧｒＲ，ｅｍｎ，ＯＬｂｔｔＣ０，ｅ— ｅｍｎ，养皿（ａｏｓＵＡ）四孑培养皿（ｕｓａ）培Ｆｌｎ，Ｓ，ＬｃＮｎ，

玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞透明带超微结构变化及体外受精效果的影响

造成卵母细胞的形态和功能受到不同程度的损伤＿６＿，
市激素制品厂）１０ＩＵ／只，４８ｈ后注射ｈＣＧ（宁波市激素制品厂）１０ＩＵ／只，于注射ｈＣＧ１４～１６ｈ后取输卵管膨大部，收集卵丘卵母细胞复合体（ＣＯＣｓ）。将ＣＯＣｓ移入含３００ＩＵ／ｍＬ透明质酸酶的Ｍ２溶液中３～５ａｒｉｎ脱去卵丘颗粒细胞，收集形态正常，胞质均匀，有第一极体排出的卵母细胞供实验用。１．３卵母细胞玻璃化冷冻与解冻１．３．１开放式拉细麦管（ＯＰＳ）的制备将０．２５ｍＬ
鼠（军事医学科学院实验动物中心）饲喂于控光条件
下（光照１４ｈ，０５：００～１９：Ｏ０），自由采食饮水。１．２卵母细胞的收集小鼠腹腔注射ＰＭＳＧ（宁波
身体积大、表面积小、对低温敏感性高的特点，至今，卵母细胞冷冻保存仍然存在着冷冻一解冻后其受精率及胚胎发育率低等问题。突出表现在冷冻会
卵母细胞冷冻保存突破了时间和空间的限制，
孔提高受精率，证实小鼠卵明带的变化引起的。但玻璃化冷冻后
卵母细胞超微结构发生何种程度的变化会引起受
可实现长期保存，建立“ 卵子库 ” ，既减少了因活体

玻璃化冷冻保存小鼠GV期卵母细胞的研究的开题报告

玻璃化冷冻保存小鼠GV期卵母细胞的研究的开题报告
一、选题背景
随着人们对基因、细胞等研究的不断深入，对于卵母细胞这一重要的生物材料的需求也越来越大，然而常规冷冻方法孕育了一系列的问题，如细胞冻存后质量的下降、解冻后细胞某些功能的丧失等问题。

因此，对于卵母细胞的冷冻保存方法进行研究显
得尤为重要。

玻璃化冷冻作为一种新兴的细胞冷冻保存技术，具有特殊的优势，已经
被广泛应用于不同种类的细胞、组织的冷冻保存研究。

因此，本文旨在探究利用玻璃
化冷冻技术保存小鼠GV期卵母细胞的可行性和适宜性。

二、研究对象和方法
1.研究对象
本文的研究对象是小鼠GV期卵母细胞。

2.研究方法
本研究采用玻璃化冷冻方法，先在细胞培养基中注入防冻剂，使卵母细胞得以适应寒冷温度，然后采用玻璃化剂处理卵母细胞，使其达到无水、粘稠的玻璃化状态，
最后用液氮进行长期储存。

在玻璃化前和玻璃化后分别对卵母细胞进行显微观察、形
态学检测和活性检测。

三、研究意义和预期结果
1.研究意义
玻璃化冷冻技术可以有效地保护卵母细胞的生命活力、形态和功能，并能够保证细胞储存的长期稳定性，因此，本研究的意义在于寻求一种更为有效可行的卵母细胞
冷冻保存方法。

2.预期结果
本研究预计可以在小鼠GV期卵母细胞上验证利用玻璃化冷冻技术进行冻存的可行性和适宜性，并在形态学、活性检测等方面进行实验数据的统计和分析，最终得出
一份权威、可靠的研究报告，可以为后续细胞冷冻保存技术的研究提供参考。

玻璃化深低温保存小鼠卵巢组织的研究

关键词细胞生物学；小鼠卵巢；玻璃化；ＡＭＨ因；Ｌ因基Ｋ基
中图分类号：Ｑ－３Ｔ６２３；Ｂ９
文献标识码：Ａ
ＳｕｙｏｙｐｒｓｒａｉｎｏｏｅＯｖｒｓｕｓｂｙＶｉｒｆａｉｎｔｄｎＣｒｏｅｅｖｔｏｆＭｕｓａｙＴｉｓｅｔｉｃｔｏｉ
ＷａｇＹｎＨａｎＷａｇＪｘＬｕＱｕｎＧｕｂＬｕｎｉｎａ ☆ ｎＹｉｇｎｅｉｉＡｎｉａｏｏｉＭｉｘａＹａｇＣａＨｎｏｎｈｏｕＷｅｂ
☆ＴａｓｓｎＩｓｔｔ，ｃｄｍｙｏｌａｙＭｅｉｌｃｅｃｓＢｉｎ，８０ＣｉａｒｎｆｉｔｕｅＡａｅｆｉｒｄｃｉｅ，ｅｉｇ１０５，ｈｎｕｏｎｉＭｉｔａＳｎｊ０
ＡｂｔａｔｓｒｃＴｈｅｅｒｈｏｒｏｒｓｒａｉｎｏｏｓｖｒｉｓｅｓｐｅｆｒｄｔｘｌｒｕｔｂｅｖｔｉｃｔｎｓｌｔｎｎｅｒｓａｃｎｃｙｐｅｅｖｔｆｏｍｕｅｏａｙｔｕｓｗａｒｏｍｅｅｐｏｅｓｉｌｉｆａｉｏｕｉｓａｄｓｏａｒｉｏｏｐｅｅｖｔｏｅｈｄ．ａｙｔｓｕｓｏ－ｅｌｏｓｒｉｓｃｅｄｃｔｉｔｉｃｓｎｈｎｔｅｒｒｏｒｓｒｅｒｓｒａｉｎｍｔｏｓＯｖｒｉｓｅｆ３ｗｅｋｏｄｍｕｅｗｅｅｄｓｅｔｄａｕｎｏｐｅｅ，ａｄｔｅｈｙｗｅｅｃｙｐｅｅｄｎｖｗｉｉｅｅｔｉｆａｉｎｓｌｔｎ．ｅｔｓｅｒｅｔｔ９￣ｏｎｅｄｔｅｅｅｔｄＴｅｂｓｉｉｃｔｎｓｌｔｎｔｄｆｒｎｔｉｔｏｕｉｓＴｈｓｕｓｗｅｅｋｐ－１６Ｃｆｒｏｅｗｅｋａｎｒｈａｅ．ｈｅｔｔｆａｉｏｕｉｈｖｒｃｏｉｏｉａｎｈｖｒｉｏｏｗａｅｅｔｄａｃｒｉｇｔｅｈｓｌｇｃｌｂｅａｉｎｏｅｔｓｅｓｉｅ．ｈｅｅｔｄｏａｙｔｓｕｓｗｅｅａｔｔａｓｌｎｅｎｏｔｅｓｓｌｃｅｃｏｄｎｔｉｔｏｉａｓｒｔｎｔｓｕｌｓＴｅｒｈａｅｖｒｉｓｅｒｕｏｒｎｐａｔｄｉｔｏｈｏｏｖｏｈｉｃｈｋｄｅａｓｌｓＴｅｓａｅ，ｈｕｏｒｎｐａｔｄｔｓｕｓｒｋｎｏｔｏｖｌａｉｎＲＴＰｉｎｙｃｐｕｅ．ｗｏｗｅｋｔｒｔｅａｔｔａｓｌｅｓｅｅｔｅｕｒａｕｔ． — ＣＲｓｕｅｅｅｔｌｎｉｗｅａｆｅｏｗａｓｄｔｄｔｃｏＡＭＨｅｅｇｎａｄＫＬｇｎ．ｅｒｓｌｈｗａｉｆａｉｎｓｌｔｎｃｍｐｓｄｏｆｌａｉｅａｅｔｔｉｈｃｎｅｔａｉｎｃｕｄｙｅｄｅｃｌｎｎｅｅＴｈｅｕｔｓｏｔｔｔｉｔｏｕｉｏｏｅｆｉｉｔｔｇｎｓｓｈｖｒｃｏｉｏｎｒｖｗｉｈｇｏｃｎｒｔｏｌｉｌｘｅｌｔｈｏｅｅｅｔｎｐｅｅａｉｎｏｕｅｏａｙｔｓｅ．ｒｃｎｌｓｏｓｔａｉｆａｉｎｏｕｅｏａｙｍａｅｆａｉｌｄｄｔｃｉｎｏｆｃｒｓｒｔｆｏｖｏｍｏｓｖｒｉｕｓＯｕｏｃｕｉｎｉｈｔｖｔｉｔｆｍｏｓｖｒｙｂｅｓｂｅａｅｅｔｆｓｉｒｃｏｎｏｇｎｘｒｓｉｎｃｕｄｂｐｌｄｔａｉａｅｔｅｑａｉｆｃｙｐｅｅａｉｎｅｅｅｐｅｓｏｏｌｅａｐｉｖｌｔｕｌｙｏｏｒｓｒｔ．ｅｏｄｈｔｒｖｏＫｅｗｏｄｌｂｏｏｙＭｏｓｖｒＶｉｆａｉｎＡＭＨｅｅＫＬｇｎｙｒｓＣｅｌｉｌｇ；ｕｅｏａｙ；ｔｉｔ；ｉｒｃｏｇｎ；ｅｅ

玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞发育能力的影响

复合体的冷冻而进行，对无卵丘细胞包围的ＧＶ期裸卵的冷冻，尚少见研究报道。另外，卵巢组织冷冻也是保存卵母细胞的一种有
１１材料，
１１预处理液．１．１％Ｅ（ｈｌｅｌｏ，ｉａ下０ＧｅｙｎｙｌＳｍ，ｔｅｇｃｇ
伤较大。
关键词：畜牧学；Ｖ期卵母细胞；Ｇ卵巢；玻璃化冷冻；小鼠中图分类号：８５１０３￥６．３．文献标识码：Ａ文章编号：２８７３（０）３０００５ — ０３２６２０１— ４０１
卵母细胞及卵巢组织的冷冻保存不仅是家畜品种
摘要：首次采用ＯＰ试验Ｓ法玻璃化冷冻小鼠ＧＶ期卵母细胞（不带卵丘细胞，同）同时尝试用ＥＦ３小下，ＤＳ０对鼠卵巢进行细管法玻璃化冷冻，究Ｇ以研Ｖ期卵母细胞冷冻后的发育潜力。首先，用ＭＥ培养和ＭＥ利ＭＭ一腔前
１１成熟培养液．３．含有５Ｂ％ＦＳ的ＭＥＧＢＯ基ＭｆＩＣ）
础液中加入０２ ห้องสมุดไป่ตู้ｏＬ丙酮酸钠（ｉａ，ｇｍ．ｍｍｌ３／Ｓｇ）０ｎ／Ｌｍ１ＥＦＳｇａ，ｇｍＧ（ｉ）５ｔ／Ｌ胰岛素（ｓｌｅＳｇａ，ｇｍｍｘｉｕｉ，ｉ）５￣／Ｉｎｎｍ
收稿［：０６０ — ３修回日期：０６０ — ８－２０—４１；ｔ期２０ — ４２
Ｓｍａ和Ｏ５ｏＬ蔗糖ｓｃｏｅＳｍ）ＰＳ液中ｉ１．ｍｌｇ／ｕｒｓ，ｉａ于Ｂ溶ｇ混匀即为Ｆ液然后用ＥＤＯ和ＦｓＧ、ＭＳＳ液按照体积比为１：５的比例混匀配制成ＥＦ３玻璃化溶液。．１：５．７ＤＳ０

小鼠卵母细胞的OPS法玻璃化冷冻保存技术

和ＥＦ４冻保存的卵母细胞进行解冻；验三：冻后的卵母细胞在ＳＩ溶液中进行孤雌激活。结果与结论ＤＳ０冷实解ｒ￣Ｃ实验一中卵母细胞解冻后的形态正常率分别高达９．％（５ ±０５）９．％（７ ±０５）均与对照组２１２ ℃ ．℃ 和２５３ ℃ ．℃ ，（８９无显著性差异（＞００）实验二中卵母细胞解冻以Ｃ法效果最佳（态正常率分别为９．％和９．％）Ｐ．５；形２５
胞激活后卵裂率和桑椹胚发育率与对照组（００ｖ．７８；２８ｖ．１９均无显著性差异（＞００）８．％ｓ７．％５．％ｓ６．％）Ｐ．。５
【关键词】卵母细胞；开放式拉长细管法；冻；冷玻璃化；鼠小【中圈分类号】￥１．８４８【文献标识码】Ｂ【文章编号】１７．８６２０）３０７．６１７５（ｏ６０．１９０６
ＥＦ）采用ＯＳ法对卵母细胞进行玻璃化冷冻保存。实验一：作台温度分别为２ ℃ ± ．℃ 和３ ℃ ±０５时，ＤＳ，Ｐ操５０５７．℃ 卵母细胞在１％Ｅ＋１％ＤＳ０Ｇ０ＭＯ或１％Ｅ０Ｇ溶液中预处理３，入ＥＦ０ｓ移ＤＳ或ＥＳ中平衡１一４进行冷冻保Ｆ５ｓ５ｓ
ＶｉｉｃｔｎｏｕｅＯｏｙｅｙＯｐｎＰｌｄＳｒｗ（ＳｔｆａｉｆｒｉｏＭｏｓｃｔｓｂｅｕｌｔａＯＰ）Ｍｅｈｄｅｔｏ

玻璃化冷冻对家畜卵母细胞细胞生物学性状影响的研究进展

玻璃化冷冻对家畜卵母细胞细胞生物学性状影响的研究进展王晶晶1，郝海生1，杜卫华1，刘岩1，庞云渭1，赵善江1，闫长亮2，赵学明1*，朱化彬1（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，家畜胚胎工程与繁殖创新团队，北京100193；2.中国牧工商（集团）总公司，北京100070）摘要：卵母细胞玻璃化冷冻技术在保存母畜生育力、加速育种过程中发挥重要作用。

相较于新鲜卵母细胞，玻璃化冷冻会造成卵母细胞细胞核混乱无序、成熟率降低、细胞质分布变化、脂质结构变化和高活性氧水平、细胞器线粒体分布异常、氧化系统和抗氧化系统异常以及膜电位降低、微管微丝排列混乱、纺锤体结构损坏以及使重要蛋白变化和一些分子发生改变。

本文从细胞生物学角度探讨玻璃化冷冻对卵母细胞造成的细胞核紊乱、线粒体膜电位降低、皮质颗粒缺失等损伤，为高效玻璃化冷冻液和冷冻程序的开发、改善玻璃化冷冻卵母细胞后续发育潜力提供参考。

关键词：玻璃化冷冻；卵母细胞；细胞器；蛋白中图分类号：S865.1+30.3 文献标识码：A DOI 编号：10.19556/j.0258-7033.20190225-03收稿日期：2019-02-25；修回日期：2019-05-08资助项目：国家自然基金面上项目（31472100）；中国农业科学院“科研英才培育工程”；中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-IAS06）作者简介：王晶晶（1994-），女，山西朔州人，硕士，主要从事动物繁殖研究，E-mail ：729968164@*通讯作者：赵学明（1979-），男，河南新乡人，研究员，研究方向为家畜胚胎生物技术，E-mail ：zhaoxueming@1977年Whittingham [1]第1次通过慢速冷冻法冷冻小鼠卵母细胞并解冻后成功产下子代，引起世界关注。

Rall 首次发明了玻璃化冷冻法，该方法是通过在冷冻过程中使胞质溶液的黏度随温度降低而增加，形成无规则的玻璃化固体，通过减少冰晶形成而降低细胞损伤[2]。

人类卵母细胞玻璃化冷冻的研究进展

人类卵母细胞玻璃化冷冻的研究进展在过去的几十年里，人类卵母细胞的玻璃化冷冻（vitrification）技术一直是生殖医学领域的一个研究热点。

玻璃化冷冻是一种冷冻技术，通过迅速降低温度并添加特殊冷冻剂，将细胞内的水分转化为无结晶的玻璃态，从而避免了冷冻过程中因冰晶形成而对细胞结构和功能造成的损伤。

人类卵母细胞是女性生育力的关键组成部分，但由于其细胞壁的特殊结构和一些衰老因素的影响，卵母细胞的冷冻保存一直是一个具有挑战性的任务。

然而，玻璃化冷冻技术的广泛应用为保存和储存卵母细胞提供了一种有效的方法。

近年来，许多研究致力于改善人类卵母细胞的玻璃化冷冻技术。

首先是冷冻剂的选择。

传统的冷冻剂通常包括甘露醇和丙二醇等，它们可以降低细胞内水分的冻结点，减少冷冻过程中对细胞的损伤。

然而，这些常规冷冻剂的使用还是会引发一定的细胞损伤，因此需要寻找更适合的替代品。

最近有研究发现，抗冻裂脱水剂（cryoprotectants）能够更有效地保护卵母细胞，如聚胺基酸和聚糖等。

其次是玻璃化冷冻的整个过程中对卵母细胞的处理。

近年来，研究者们发现，在卵母细胞冷冻之前，对细胞进行一定时间的预处理，能够减少其在冷冻过程中的受损程度。

例如，细胞的快速预冷冻过程能够减少其在冷冻时所受到的冷冻损伤。

此外，对卵母细胞进行精心设计的膜处理和包覆技术，也能显著提高细胞的冷冻保存率。

创新的玻璃化冷冻设备和技术也对人类卵母细胞的冷冻保存起到了积极的促进作用。

人类卵母细胞是非常敏感的细胞，需要在非常短的时间内完成冷冻，避免冷冻过程中对细胞的额外损伤。

因此，一些新型的冷冻设备，如快速冷冻器和微流控器，能够在非常短的时间内将细胞迅速冷冻，从而避免了细胞因长时间接触冷冻剂而产生的冷冻损伤。

此外，越来越多的研究关注卵母细胞冷冻后的质量评估。

传统的评估方法主要依靠检测冷冻后的细胞形态和一些形态学指标，但这种方法对早期胚胎的质量评估并不准确。

近年来，一些新兴的技术，如单细胞转录组测序和代谢组学分析，能够更准确地评估冷冻后卵母细胞的质量和其潜在的发育能力。

新生小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存与异体异位移植研究

新生小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存与异体异位移植研究廖海艳;周卫国;王方剑【摘要】开展小鼠新生胎儿卵巢组织冷冻保存与移植研究,为建立家畜卵巢组织冷冻保存与移植技术奠定基础.采用微滴法玻璃化冻存方法处理卵巢,卵巢复苏后移植到昆明系雄性小鼠受体肾囊下,19只雄性受体鼠接受了卵巢移植,每侧肾囊移植2枚,卵巢共移植1日龄小鼠卵巢38个.饲喂28 d有效回收移植卵巢的受体鼠为17只,受体总有效率分别为89.4%;有效回收移植卵巢30个,卵巢总回收率为78.9%.结果表明,小鼠早期卵巢经过冷冻、解冻并异体异位移植后,其原始卵泡能够重新启动生长发育.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2010(031)009【总页数】5页(P71-75)【关键词】小鼠;玻璃化冷冻保存;卵巢移植【作者】廖海艳;周卫国;王方剑【作者单位】湖南省第一师范学院,湖南长沙,410205;湖南省永州零陵区畜牧水产局动物防疫监督站,湖南永州,425006;湖南省第一师范学院,湖南长沙,410205【正文语种】中文【中图分类】S853.52卵巢移植起源于19世纪末期,最初用于治疗绝经期妇女和双侧卵巢切除而产生的不良反应。

到1935年,由于自体移植效果不理想,而异体移植效果更差,使得这一技术被长期搁置。

在近10年中,经过不断的摸索,卵巢冷冻保存后进行移植在不同的动物都取得一定的成果[1]。

如用从狨和小鼠卵巢组织移植到雌性受体中获得的卵母细胞已经完成了受精及胚胎分割。

本研究将利用玻璃化冷冻方法开展小鼠新生胎儿卵巢组织冷冻保存与移植研究,为建立家畜卵巢组织冷冻保存与移植技术奠定基础。

1.1.1 实验动物昆明小鼠(KM Mice)购自湖南中医学院实验动物中心,自繁1日龄(出生当天为第1天)雌鼠作为卵巢供体,7周龄～12周龄雄鼠作为卵巢移植受体。

试验小鼠在自然光照、22℃～25℃环境温度条件下饲养,自由饮食、采食。

1.1.2 主要试剂Leibovitz 15(L-15)培养基购自Invitrogen公司;新生牛血清(NBS)购自北京鼎国生物科技有限公司;乙二醇(EG)购自国药集团化学试剂有限公司;二甲基亚砜(DMSO)购自 Amresco公司;蔗糖(sucrose)购自北京鼎国生物科技有限公司;乙酰胺(acetamide)购自上海楷洋生物技术有限公司;注射用青霉素钠(benzylpenicillin sodium for injection)购自哈药集团制药总厂;注射用硫酸链霉素(srteptomycin sulfate for injection)购自大连美罗大药厂;基础液(L-15*液)在湖南农大动物医学院的临床分子医学实验室自行配制(LeibovitzL-15+100 mL/L NBS+100IU/mL青霉素钠+100 IU/mL硫酸链霉素)。

小鼠胚胎玻璃化冷冻的研究进展

小鼠胚胎玻璃化冷冻的研究进展
刘丽均;徐平
【期刊名称】《中国比较医学杂志》
【年(卷),期】2001(011)002
【摘要】玻璃化冷冻是继常规冷冻方法之后发展起来的一种冷冻方法,它操作简单且不需要高精度的冷冻仪.玻璃化冷冻的效果与玻璃化溶液的种类、冷冻方法及胚胎的不同品种及时期有关.本文综述了近年来有关胚胎玻璃化冷冻的研究进展.【总页数】3页(P115-117)
【作者】刘丽均;徐平
【作者单位】中国科学院上海实验动物中心,上海 200233;中国科学院上海实验动物中心,上海 200233
【正文语种】中文
【中图分类】Q954.4
【相关文献】
1.玻璃化冷冻胚胎与新鲜胚胎移植对子代小鼠生长发育的影响 [J], 周经委;吴蓉花;郭里;孙琴;丁晓萌;随刘才;陈莉
2.OPS玻璃化冷冻对小鼠四倍体胚胎体外发育的影响 [J], 谢璐;徐志远;张鲁;吕文发;刘国世
3.小鼠胚胎玻璃化冷冻方法的改进研究 [J], 高妍;郝金栋;袁宝;姜昊;陈承祯;张嘉保
4.内外受精及玻璃化冷冻对小鼠胚胎体外发育的影响 [J], 周燕雯;朱建国
5.单胚胎玻璃化冷冻对小鼠胚胎体外发育的影响 [J], 贾思思;付锴;张昌军;彭海英
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摘要　自制冷冻叶玻璃化冷冻小鼠自然周期及超排卵周期卵母细胞的研究研究生: 高静导师: 蔡霞教授摘要目的：　以小鼠为研究模型，拟建立优化的玻璃化冷冻卵母细胞方法以及了解促排卵后卵母细胞的冷冻复苏率及体外受精率，为人类卵母细胞玻璃化冷冻技术的改善提供基础研究依据。

方法：　建立小鼠超排卵及自然周期模型，比较ｏｐｓ（ｏｐｅｎｐｕｌｌｅｄｓｔｒａｗ开放式拉细麦管）及叶片两种玻璃化冷冻载体冷冻小鼠卵母细胞的复苏率及体外受精率。

结果：１：叶片法玻璃化冷冻卵母细胞复苏率皆高于ＯＰＳ法，（自然周期组：７５％＞５５．６％，Ｐ＝０．０００３，超排卵周期组：６５．３％＞４６．３％，Ｐ＝０．００００）。

２：自然周期组卵母细胞的冷冻复苏率（ＯＰＳ组：５５．６＞４６．３％，Ｐ＝０．０４２２，叶片组：７５％＞６５．３％，Ｐ＝０．０２５６）及体外受精率（ＯＰＳ组：５２．８＞３９％，Ｐ＝０．０２６８，叶片组：５３．４％＞４０．５％，Ｐ＝０．０１７）均高于超排卵周期组。

结论：１：叶片载体玻璃化法优于ＯＰＳ载体玻璃化法；２：自然周期组小鼠卵母细胞玻璃化冷冻复苏率及体外受精率均高于超排卵周期组。

关健词：控制性超排卵（ＣＯＨ）；水通道蛋白（ＡＱＰ３）；玻璃化冷冻；　卵母细胞　—1—新疆医科大学医学硕士学位论文　The Study of (Self-Made)Cryleaf Vitrification Of Mouse Ⅱ Oocyte Of Natural cycle And Controlled Ovarian Stimulation CyclePostgraduate : Gao Jing Supervisor : Cai XiaAbstractObjective : To find the better method of vitrified oocytes. make mouse as model and study the effects of the controlled ovarian stimulation to the survival rate of mouse oocyte and the fertilization rate for vitrification ,so that we can give some evidence to improve the vitrification method of human oocyte. Method: To set up the natural and controlled ovarian stimulation cycle models of mouse ,then compare the survival and fertilization rate of two groups mouse oocytes for vitrification between using OPS and (self- made )cryoleaf .Result: (self- made)Cryoleaf had significantly higher precentages of survial rate and fertilization rate than OPS, (natural cycle group: 75%> 55.6 P=0.0003, controlled ovarianstimulation cycle group:65.3%>46.3%, P= 0.00 00). 2: The survival and fertilization rate of natural cycle group is higher than the controlled ovarian stimulation cycle group .(cryleaf group:75%>65.3%,P=0.0003 and 52.8 >39% P= 0.0 2 68 ,ops group:55.6>46.3% P=0.0422,and 53.5%>40.5% P=0.017) . Conclusion：1.Vitrification method of mouse oocytes using cryoleaf is better than using OPS .2.The survival and fertilization rate of natural cycle group is higher than the controlled ovarian stimulation cycle group. key words ： Controlled ovarian hyperstmulation(COH); Aquaporin (AQP3） ; Vitrification; Oocyte —2—中英文缩略词对照表　英文缩写 ART OPS PMSG HCG VS PBS DMSO EG MⅡ期 COH S IVF COCs AQP3 GV 期 ET ICSI FSH LH CPA 英文全称 Assisted reproductive technology Open pulled straw Pregnant mare, serum gonadotropin Human chorionic gonadotropin Vitrification solution Public Broadcasting Service Dimethyl sulfoxide Ethylene glycol Meiosis Ⅱ Controlled ovarian hyperstimulation Sucrose In Vitro Fertilizatin Cumulus oocyte complex Aquaporin 3 Germinal vesicle Embyro transfer Intracytoplasmic sperm injection Follice stimulation hormone Luteinizing hormone Cryopreservation 中文译名辅助生育技术开放拉长塑料细管法孕马血清绒毛膜促性腺激素玻璃化溶液磷酸盐缓冲液二甲基亚酚乙二醇第一次减数分裂中期控制性超排卵蔗糖体外受精卵丘卵母细胞复合物水通道蛋白３生发泡期胚胎移植卵母细胞浆内单精子注射卵泡刺激素黄体生成素冷冻保护剂　　学位论文独创性说明　本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的成果。

据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。

对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。

研究生签名：时间：年月日学位论文版权授权书　本人完全了解新疆医科大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。

有权将学位论文用于赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查询。

有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。

保密的学位论文在解密后使用本规定。

研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日　前言　前言随着辅助生育技术的发展,冷冻生物学在人类生殖医学领域也得到了迅速的应用和发展。

人类胚胎冷冻已经广泛应用于不孕症患者的常规治疗,并获得了良好的结果。

尽管也有利用冷冻卵子的健康婴儿出生报道,然而由于卵子本身的生物学特征等原因, 目前卵子冷冻后的存活率、受精率、卵裂率都不尽人意,导致冷冻复苏后进行IVF的成功率极低,与胚胎冷冻相比较,卵子冷冻仍处于探索、研究阶段。

体外受精- 胚胎移植(in vitro fertilization – embryo transfer , IVF - ET) 治疗中由于广泛采用超排卵( superovulation) 方法,获得的卵子数目往往多于一次移植1～3 个胚胎所需的数量,有一定的卵子或胚胎的浪费，因此相对而言卵子冷冻较胚胎冷冻具有更多的优势。

对于从事影响生育力工作(如接触放射线、有毒物等 ) 及将接受某些损伤生育的治疗(卵巢、盆腔手术、放疗、化疗) 的女性,在治疗前做卵子冷冻或卵巢皮质块的冷冻是保存生育力的唯一方法。

卵母细胞的冷冻为人类优生开辟新的途径，因为如果女方是遗传病患者或遗传病基因携带者 ,结婚生育很可能导致劣生 ;如果这样的夫妻通过提供健康女性的卵子进行生育,既可以满足生一个孩子的愿望,又可以促进优生。

再者由于社会的发展,许多妇女在年轻时不愿生育或由于工作压力不能生育,冷冻卵子、储备生育能力,也是解决将来担心卵子老化,影响优生问题的良好方法之一。

有的夫妻婚后长期不孕,往往给和谐的家庭带来不安定的因素。

根据不育症患者情况, 利用冷冻卵子可以解决女性不孕症患者的痛苦 ,减少不孕症治疗上的花费 ,并且如同供精一样为供卵提供一个检疫期从而降低了患人类性传播疾病的风险。

同时卵母细胞能够解决因胚胎冷冻带来的宗教、伦理、法律和临床上的一系列棘手问题。

如目前在德国、奥地利、瑞士等国家就限制或禁止胚胎冷冻。

随着辅助生殖技术的不断发展及当今社会的需求 ,卵母细胞的超低温保存成为一种热门技术,如今,辅助生殖技术正朝着简单、高效的方向发展,而玻璃化冷冻技术是一种无需降温仪精密控制降温速度,室温下即可进行的冷冻技术。

其操作简便、冷冻损伤小,已成为目前国际上研究的热点问题之一。

迄今为止,已有采用玻璃化冷冻方法对人的未成熟卵细胞、成熟卵细胞、卵裂期胚胎及囊胚进行冷冻的成功报道,且有个例临床妊娠并足月分娩。

冻存人类卵母细胞是一项极具价值和吸引力的技术。

由于冷冻损伤造成的较低的冷冻后复苏率致使此项技术至今不能广泛用于临床。

目前亦无标准一致的冷冻方法与方案, 而不同的冷冻方法的冷冻效果差异很大, 探索一种可行的冷冻方法是生殖医学工作者们努力的方向。

由于人类卵母细胞的研究受到取材和伦理的限制,小鼠卵母细胞已作为被广泛应用的模型,代替人类卵母细胞用于研究。

冷—3—新疆医科大学医学硕士学位论文　冻保存小鼠卵母细胞的研究开始于20世纪50年代[1]。