第5讲 目的基因的克隆与分离

第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。

目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。

本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。

一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。

PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。

PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。

2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。

基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。

其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。

基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。

3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。

这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。

限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。

二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。

它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。

分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。

2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。

这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。

化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。

3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。

通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。

第五章目的基因的获取第五章目的基因的获取1976年H.G. Khorana 提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA 基因的论文。

第一节化学合成目的基因目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。

①保护dNTP 的5’端P 或3’端-OH （1）原理1. 磷酸二酯法保证合成反应的定向进行。

然后再用酸②带保护的单核苷酸连接或碱脱去保护基团带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。

然后去掉一个保护，使其循环往复连接。

（2）合成过程5’端保护的单核苷酸可以同3’端保护的二核苷酸聚合。

保护连接去保护连接原理与磷酸二酯法一样。

只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH 上都先连接了一个保护基团。

2. 磷酸三酯法固相磷酸三酯合成法将第一个核苷酸的3’-OH 端固定在固相支持物上。

（第一个核苷酸不需要保护）固相磷酸酯合成法是目前通用的合成方法。

化学合成的DNA 片断一般在200bp 以内。

需要把几个正确片段连接起来二、化学合成DNA 片断的组装1. 互补连接法（1）互补配对用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。

预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域形成有断点的完整双链。

（2）5’端磷酸化T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化（3）连接酶连成完整双链T4 DNA连接酶完整的DNA双链2. 互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。

3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物1. 直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点（1）有些组织特异性mRNA的含量很低，很难用cDNA方法克隆）有些基因比较短化学合成费用较低2. 合成测序或PCR用的引物（20bp左右）（2）有些基因比较短，化学合成费用较低3. 合成探针序列以筛选特定的基因4. 定点突变合成合成带有定点突变的基因片段。

第1讲基因工程和细胞工程[考纲要求] 1.基因工程的诞生(Ⅰ)。

2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)。

3.基因工程的应用(Ⅱ)。

4.蛋白质工程(Ⅰ)。

5.植物的组织培养(Ⅱ)。

6.动物细胞培养与体细胞克隆(Ⅱ)。

7.细胞融合与单克隆抗体(Ⅱ)。

8.实验：DNA的粗提取与鉴定。

11．基因工程(1)基因工程的3种基本工具①限制性核酸内切酶：识别特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子。

②DNA连接酶：a.E·coli DNA连接酶只能连接黏性末端；b.T4 DNA连接酶能连接黏性末端和平末端。

③载体：需具备的条件包括：a.能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；b.有一个至多个限制酶切割位点；c.具有特殊的标记基因，以便对含目的基因的受体细胞进行筛选。

(2)获取目的基因的途径：①从基因文库中获取；②利用PCR技术扩增；③化学方法直接人工合成。

(3)基因表达载体的组成：启动子、目的基因、终止子及标记基因等。

(4)将目的基因导入受体细胞①植物：体细胞或受精卵——常用农杆菌转化法(双子叶植物和裸子植物)、花粉管通道法、基因枪法(单子叶植物)。

②动物：受精卵——显微注射技术。

③微生物：细菌(常用大肠杆菌)——感受态细胞法(钙离子处理法)。

(5)目的基因的检测与鉴定方法2①检测目的基因是否插入转基因生物的DNA上：DNA分子杂交技术。

②检测目的基因是否转录出mRNA：分子杂交技术。

③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。

④个体生物学水平鉴定：根据表达性状判断。

易混辨析①限制酶≠DNA酶≠解旋酶限制酶的作用是识别双链DNA分子上某种特定的核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开；DNA酶的作用是将DNA水解为基本组成单位；解旋酶的作用是将DNA两条链间的氢键打开形成两条单链。

②DNA连接酶≠DNA聚合酶DNA连接酶能连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。

现代生物技术摘要：现代生物技术，主要包括五项技术：基因工程，细胞工程，酶工程，蛋白质工程，发酵工程。

五项技术的应用十分广泛，在人们的生产生活中占有重要地位。

关键词：基因工程细胞工程酶工程蛋白质工程发酵工程应用随着时代的发展，现代生物技术在人们的生活中也越来越重要了。

现代生物技术对解决人类面临的重大问题如：粮食、健康、环境和能源等将开辟广阔的前景，因此越来越为各国政府和企业界所关注，现代生物技术已经与信息、新材料和新能源技术并列成为影响国计民生的四大科学技术支柱，是21世纪高新技术产业的先导。

生物技术(biotechnology),也称生物工程(bioengineering)，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品的技术。

生物技术是由多个学科综合而成的一门新学科。

主要包括以下5项技术：1.基因工程（gene engineering）2.细胞工程（cell engineering）3.酶工程（enzyme engineering）4.发酵工程（fermentation engineering）5.蛋白质工程（protein engineering ）。

一、基因工程基因工程原称遗传工程。

从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。

广义的基因工程定义为DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。

上游技术指的是外源基因重组、克隆和表达的设计与构建；而下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。

基因工程之所以能够实现，主要有六个原因：1.不同基因具有相同的物质基础；2. 基因是可切割的；3. 基因是可以转移的；4. 多肽和基因之间存在对应关系；5. 遗传密码是通用的；6. 基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。

克隆技术介绍张勋学号：160820216摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。

人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。

本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。

一、克隆技术实质1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆(Clone)”的术语。

学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。

早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。

1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。

在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。

克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。

克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。

时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。

这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。

简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。

但克隆与无性繁殖是不同的。

克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。

植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。

一、名词解释诱变育种:利用诱变剂处理微生物细胞, 提高基因突变频率, 再通过适当的筛选方法获得所需高产优质菌种的方法。

代谢控制发酵:是指利用生物的、物理的、化学的方法, 人为的改变微生物的代谢途径, 使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。

寡核苷酸介导诱变( ):指在水平上改变氨基酸的编码序列, 也称定点诱变( );补料分批培养:在分批培养过程中补入新鲜的料液, 以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。

临界溶氧浓度:指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。

诱导酶:有些酶在通常的情况下不合成或很少合成, 当加入诱导物后就会大量合成, 这样的酶叫诱导酶固定化酶:通过物理的或化学的方法, 将酶束缚于水不溶的载体上, 或将酶束缚于一定的空间内, 限制酶分子的自由流动, 但能使酶发挥催化作用的酶.非水酶学:通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的, 研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学.抗体酶:是一种具有催化作用的免疫球蛋白, 属于化学人工酶细胞培养:是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长, 此时细胞不再形成组织．愈伤组织:在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。

接触抑制:细胞从接种到长满底物表面后, 由于细胞繁殖数量增多相互接触后, 不再增加。

细胞系:原代细胞经第一次传代后, 形成的细胞群体, 即具有增殖能力, 类型均匀的培养细胞, 一般为有限细胞系。

抗性互补筛选法:利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂与其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。

细胞拆合:是指以一定的实验技术从活细胞中分离出细胞器与其组分, 然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器与其组分进行重组, 使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器.基因重组 ( ):是指片段在细胞内、细胞间, 甚至在不同物种之间进行交换, 交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。

克隆:来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。

限制性内切酶:限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶, 能将外来的切断, 由于这种切割作用是在分子内部进行的, 故名限制性内切酶。

实验单元6：基因克隆学号No.：姓名Name：日期Date：2014，04，26摘要：基因克隆是在体外将目的基因（或其它有意义的DNA片段）同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究。

通过PCR法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。

本实验应用RT-PCR技术从团头鲂肝脏RNA中扩增β-actin基因cDNA片段，并克隆到质粒载体pMD18-T，鉴定测序。

结果显示：只有少数组别成功克隆出目的基因片段。

关键词：基因克隆；T-A克隆；团头鲂；β-actin基因一、前言对PCR产物进行克隆是分子生物领域以及基因工程领域中常用的方法，随着PCR方法应用的多元化，PCR产物的克隆显得尤为重要。

以前对PCR产物进行克隆实验，采用的方案大概有以下几种：一是用Klenow酶或单链核酸酶（如S1核酸酶或绿豆核酸酶）将PCR产物的两端切成平末端，然后克隆到也切成平端的质粒载体上，或在PCR产物的两端加上人工接头（Linker），经过限制性内切酶处理以后，再克隆到用相应限制性内切酶酶切产生的载体上；二是在设计PCR产物时，在引物的)!端引入特异性的内切酶识别序列，在PCR反应结束后，将PCR产物用相应的限制性内切酶进行处理，使之两端产生粘性末端，以便于克隆到载体的相应酶切位点上[1]。

这两种方法都很烦琐，而且，第一种方法的克隆效率很低，第二种方法在进行酶切处理时，如果PCR产物本身含有相应的酶切位点时，则有可能切断PCR产物。

近年来发展了几种PCR产物的直接克隆方法，一种是T4 DNA 聚合酶补平，另一种是T-A克隆法。

其中，T-A克隆法不仅操作简便，而且大大提高了克隆效率，已经成为克隆PCR产物的主要方法之一。

但是，在采用T-A克隆法时，随着插入片段长度的增加，克隆效率明显下降，尤其是当PCR产物长度大于3000bp时，其克隆效率甚至会低于平末端的克隆效率。

基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。

2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。

命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。

如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。

并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。

3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。

种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。

4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。

②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。

③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。

5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。