肝组织总蛋白提取的标准操作规程

上海临床研究样本中心质量管理体系文件编号 SOP-SC-016文件名称 蛋白质提取和保存操作规程制 定 人 审 核 人 批 准 人制定日期 审核日期 批准日期制定部门 分发部门 实施日期蛋白质提取和保存操作规程1.目的本规程规定了人体组织细胞蛋白质提取和保存的工作程序和技术要求。

2.适用范围本规程适用于人体组织细胞蛋白质(如总蛋白、细胞膜蛋白、细胞核蛋白和细胞质蛋白等)的提取和保存。

3.参考标准与文献GB 19489-2004 《实验室生物安全通用要求》CNAL/AC30-2005 《实验室生物安全认可准则》ISO 15189 《医学实验室质量和能力的专用要求》ISO 9001:2000 《质量管理系统要求》GB/T 1.1-2000 《标准的结构和编写规则》4.定义和术语4.1人体组织细胞 human tissue and cell指人体的各种脏器组织以及体外培养的贴壁和悬浮细胞。

4.2有效成分 effective component指欲纯化的某种单一的物质。

而有效成分以外的其他物质则统称杂质。

4.3破碎 rupture指用物理、化学、等方法来破坏细胞膜从而将胞内物质释放至周围环境的过程。

4.4提取 extraction指用适当的溶剂和方法，将经过处理或破碎的细胞中被提取的蛋白质充分释放出来并与杂质分离的过程。

5.职责6.正文6.1组织蛋白的提取6.1.1脏器组织的选择及预处理新鲜获取的脏器组织用缓冲盐溶液洗去残留血液和污染物，迅速剥去脂肪和筋皮等结缔组织，冲洗干净。

用组织剪或手术刀将组织分离成1cm3左右的小块。

最好选择新鲜的组织，但有些情况下，如果是以小块组织快速冰冻并且保存时间不长的话，也可选用冰冻组织。

建议冰冻组织保存在-50℃以下，因为由于冰晶形成导致的溶媒体蛋白酶的释放可能引起蛋白的降解。

对于易分解的蛋白质，应选用新鲜材料制备。

6.1.2组织的破碎人们所需的蛋白有些分泌于细胞外，用适当的溶剂可直接提取；多数存在于细胞内，游离在细胞质中或与细胞器紧密结合。

肝组织总蛋白提取的标准操作规程肝组织总蛋白提取的标准操作规程（编号：025）1、目的及适用范围该SOP用来规范肝组织总蛋白提取的操作。

2、主要仪器及试剂均质仪、铁架台、冷冻台式离心机、微量移液器、单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX-100，100μg/mL PMSF）3、相关器皿的预处理剪刀和均质仪的转头需彻底清洗后高压灭菌。

4、操作步骤4.1 将少量肝组织块置于玻璃平皿中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，同时去除结缔组织。

4.2 每100mg组织加400μL单去污剂裂解液（含PMSF）于15mL离心管中，使用均质仪进行匀浆，冰上操作。

4.3保持组织块低温状态，均质仪运行3s，停顿2s，直至组织完全碾碎成浆。

4.4 用微量移液器将裂解液移至1.5mL 离心管中，然后在4℃ 12000rpm离心5min，取上清分装于0.5mL离心管中并置于-20℃保存。

5、问题向导蛋白得率低可能原因：5.1 组织裂解不彻底5.2 提取过程中的蛋白降解6、注意事项注意初始组织块的处理，尽量剪碎，尽量去除结缔组织。

匀浆彻底，同时保证匀浆过程低温，防止蛋白降解。

根据提取效果，适当调整Detergent的成分。

附：单去污剂裂解液配制方法单去污剂裂解液：50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX-100，100μg/ml PMSF 1moL/L Tris·HCl（pH8.0）2.5mLNaCl 0.438g50。

组织总蛋白提取步骤
总蛋白提取是从细胞或组织中提取出的所有蛋白质的混合物。

总蛋白
的提取对于生物学研究和许多实验室技术都至关重要。

以下是一般的总蛋
白提取步骤：
1.组织的收集和处理：
a.收集需要提取总蛋白的组织样品，并尽快处理以防止蛋白质降解。

b.使用冰凉的无菌生理盐水将组织样品洗涤以去除任何外部污染物。

c.如有必要，将组织样品研磨成细小的粉末状，以提高蛋白质的释放。

2.细胞破碎和裂解：
a.使用合适的细胞破碎方法（如液氮研磨、机械破碎器或超声波处理）破碎细胞膜，释放细胞中的蛋白质。

b.加入破碎缓冲液（通常是一种含有盐和蛋白质保护剂的缓冲液），
并将样品在低温下裂解，以避免蛋白质的降解。

3.离心：
a.将处理后的样品进行高速离心，以去除细胞碎片和其他杂质。

b.将上清液（含有总蛋白）转移到干净的离心管中。

4.测定蛋白质浓度：
a. 使用适当的蛋白质浓度测定方法（如二维凝胶电泳、BCA法、Bicinchoninic Acid法）测定总蛋白的浓度。

b.根据测定的浓度进行相应的稀释或浓缩。

5.进一步处理或分析：
a.根据具体实验目的，可以进一步处理总蛋白提取物，如进行蛋白酶消化、亲和层析或其他分离纯化方法。

b. 可以使用各种蛋白质分析技术（如SDS-凝胶电泳、Western blotting、质谱等）对总蛋白进行定性和定量分析。

总蛋白的提取步骤中，诸如细胞破碎方法、破碎缓冲液的配制、离心条件和测定蛋白质浓度的方法等，都需要根据具体需求和实验目的进行优化和调整。

同时，注意使用无菌操作和低温条件，以保证蛋白质的完整性和稳定性。

Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白Protocol1.细胞计数（约1×106的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；2.预冷1×PBS 500ul重悬洗一次，转至500ul EP管（2000rpm×5min）；3.去上清，后甩一次，将上清去尽；4.按每1×106的细胞加50ul loading buffer 加入2×loading；5.V ortex一下，煮10～15min一次×2～3次直至无粘丝；6.每次煮好将其放于冰上，静置约2min，V ortex一下，再甩一下；7.三次后用枪吸起，如没有粘丝，即可；8.每次上样约5ul（50ug/ul蛋白）RIPA裂解抽提总蛋白Protocol1.细胞计数（约1×107的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；2.预冷1×PBS 1ml重悬洗2次，转至1.5ml EP管（2000rpm×5min）；3.去上清，后甩一次，将上清去尽；4.按照如下比例加入裂解试剂：RIPA：300ul/1×107细胞PMSF：3ul(1:100)Cocktail ：0.3ul(1:1000)5.吹打均匀，冰上放置30-40min，中间每10分钟V ortex一次；6.4℃预冷离心：10000rpm ×10min；7.收集上清，转移至已预冷新EP管，即为总蛋白。

【为了浓缩蛋白，加RIPA的量改为200ul或者更低，可稍微延长冰上裂解时间，而RIPA（1）＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）的比例不变】核，浆蛋白抽提Protocol一.收核-浆蛋白收浆蛋白1.细胞计数（约1.5×107的细胞），离心收集细胞（1100rpm×5min）；2.用4℃预冷的PBS重悬，转至1.5mL的EP管中，离心（4000rpm×5min，4℃）；3.去上清，加入A Buffer1mL/1×107 cell，重悬，4℃放置10min，离心（2500rpm×3min，4℃）；4.去上清，加入A’Buffer250uL/1.5×107cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸取上清（上清是浆蛋白）；收核蛋白5.再用A’ Buffer 500uL/1.5×107 cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸走上清，12000rpm×30sec，把上清完全吸干净；6.剩余沉淀中加入B’Buffer (或者RAPI)50uL，重悬（振荡），4℃放置40min（每隔10min振荡一次）；7.离心（12000×10min，4℃），取上清即为核蛋白，－80℃保存。

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）人工肝实验室学习姚瑶（一）目的蛋白提取：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。

2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。

共洗三次，每次十分钟。

3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。

4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。

（可不做）5、4℃，12000转离心10min。

6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。

（2）组织中总蛋白的提取：1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。

冰上裂解30min。

2、配平后，4℃，14000转离心10min。

3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定：1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。

2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。

3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。

4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。

5、37℃水浴30min。

6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。

7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。

（三）SDS-PAGE电泳：（1）清洗玻璃板（2）灌胶与上样：1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

总蛋白提取物进行免疫沉淀
总蛋白提取物是从细胞或组织中提取的包含所有蛋白质的混合物。

免疫沉淀是一种实验技术，用于分离和富集特定蛋白质或蛋白质复合物。

在进行总蛋白提取物的免疫沉淀时，通常会涉及以下步骤：
1. 样品制备，将细胞或组织破碎并溶解在合适的缓冲液中，以获得总蛋白提取物。

2. 抗体结合，选择特异性抗体，并将其结合到磁珠、琼脂糖或其他固相载体上，形成免疫复合物。

3. 免疫沉淀，将抗体-蛋白质复合物加入总蛋白提取物中，允许特定蛋白质与抗体结合形成免疫复合物。

4. 洗涤，通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质，以提高目标蛋白质的纯度。

5. 洗脱，使用适当的缓冲液将目标蛋白质从抗体上洗脱，以便进一步的分析或应用。

进行总蛋白提取物的免疫沉淀时，需要注意以下几点：
1. 抗体选择，选择具有高亲和力和特异性的抗体至关重要，以
确保目标蛋白质能够有效结合并富集。

2. 实验条件优化，包括抗体浓度、洗涤条件和洗脱条件的优化，以最大程度地提高免疫沉淀的特异性和产量。

3. 结果验证，使用Western blot、质谱分析或其他方法验证
免疫沉淀富集的蛋白质的纯度和特异性。

总的来说，总蛋白提取物的免疫沉淀是一种强大的工具，可用
于富集和分离特定蛋白质，为蛋白质相互作用、信号通路研究和生
物标志物发现提供重要信息。

在实验设计和执行中，细致的操作和
条件优化对于获得可靠的结果至关重要。

固体组织蛋白提取
1. 每100mg固体组织剪碎后加入0.5 ml裂解液，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次；或用高速机械匀浆器12,000 rpm 破碎组织。

注意：初始组织的量应在10-100mg范围。

肝肾组织蛋白含量高，提取时应加较少量的组织，否则形成的蛋白膜厚、致密且难溶。

2. 取0.5ml组织匀浆液转移到1.5ml离心管，加2倍体积的(1 ml)抽提试剂充分混匀。

室温或4℃静置10分钟，偶尔晃动。

注意：(1)组织量<10mg且静置时间短30min，在下一步离心时所形成的蛋白膜易碎，此时可静置30min。

(2)提取脂肪组织时应4℃静置40min 以上以充分去除油脂。

3. 10,000g 4℃离心10分钟，溶液分为两相，中间为蛋白膜。

吸除上层液体；随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体。

蛋白膜将附着于离心管壁。

注意：(1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固，难以溶解。

(2)如果初始组织量较少(<10mg)，离心后难以得到完整的蛋白膜，此时可吸去上下层液体，加入0.5-0.8ml纯乙醇混匀，10,000g 4℃离心5分钟。

弃所有液体，蛋白沉淀在管底。

4. 敞开管口，室温10分钟空气干燥沉淀。

5. 每100mg组织所得到的蛋白加 200ml用户自备的缓冲液，
95℃煮10分钟。

室温放置20分钟溶解沉淀。

注意：(1)可4℃过夜溶解沉淀，偶有少量不溶性组织纤维碎片可离心去除。

(2)有时染色体DNA可与蛋白质一起被抽提出来，溶解时则形成粘稠物。

延长95℃热变性时间、不时振荡、用注射针头反复抽吸，有助于彻底打断DNA。

1肝组织蛋白的提取准备物品：PBS （提前消毒，4℃过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，EP管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作均在冰上）1）取出肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状2）加入组织裂解液约500μL（裂解液:PMSF=100:1），冰上作用20~30min3）吸取组织液到已高压灭菌的Ep管中，4℃离心，12000rpm×15min 4）取出EP管放在冰盒内,仔细吸取上清，取2μl的上清用于蛋白浓度的测定5）剩余上清，按蛋白：5xbuffer=4:1的比例加入5xbuffer,煮沸10min 6）瞬时离心，放入-20℃冰箱冻存备用。

2. RNA抽提1、取等量肝组织，液氮中磨碎；2、加入TRIZOL Reagent lml，室温孵育5min；3、 )b[I)k2001al氯仿剧烈振荡l 5sec，室温孵育2min；4、 4℃，12，000rpm，离心15min；5、吸取上层含有RNA的水相入新管，Dla入500rtl异丙醇沉淀RNA，室温孵育l 0min；6、 4℃，12，000rpm，离心l 5min；7、弃上清，加入lml 75％的乙醇洗涤RNA沉淀，4"C，75009，离一L,5min；8、干燥RNA，用20tal DEPC水溶解RNA；9、用紫外分光光度计测定RNA的含量，．20℃保存，准备做RT．PCR。

2蛋白浓度测定1）蛋白标准液（用BSA配制）25mg/ml储存液，稀释为0.5mg/ml，稀释步骤：例：10μL 25mg/ml的蛋白标准液＋90μL PBS混合成2.5mg/ml蛋白标准液20μL 2.5mg/ml的蛋白标准液＋80μL PBS混合成0.5mg/ml蛋白标准液2）需设置八个标准孔以绘出标准曲线，采用BCA试剂盒测出蛋白浓度，标准孔设置及所加试剂量如下：试剂添加量（μL）蛋白标准液3）配制BCA蛋白测定液，溶液A：溶液B=50：1先混合均匀，至完全互溶备用4）待测蛋白孔加：2μL蛋白液+18μL PBS，每孔的体积均为20μL5）每孔加180μL配好的BCA蛋白测定液，使每孔总体积均为200μL；6）室温避光放置两个小时或37℃放置30min；7）用酶标仪测出每孔的吸光度，（570nm），测三次；8）用excel工具根据标准孔的数据作散点图，并做出直线及公式。

1肝组织蛋白的提取准备物品：PBS （提前消毒，4℃过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，EP管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作均在冰上）1）取出肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状2）加入组织裂解液约500μL（裂解液:PMSF=100:1），冰上作用20~30min3）吸取组织液到已高压灭菌的Ep管中，4℃离心，12000rpm×15min 4）取出EP管放在冰盒内,仔细吸取上清，取2μl的上清用于蛋白浓度的测定5）剩余上清，按蛋白：5xbuffer=4:1的比例加入5xbuffer,煮沸10min 6）瞬时离心，放入-20℃冰箱冻存备用。

2. RNA抽提1、取等量肝组织，液氮中磨碎；2、加入TRIZOL Reagent lml，室温孵育5min；3、 )b[I)k2001al氯仿剧烈振荡l 5sec，室温孵育2min；4、 4℃，12，000rpm，离心15min；5、吸取上层含有RNA的水相入新管，Dla入500rtl异丙醇沉淀RNA，室温孵育l 0min；6、 4℃，12，000rpm，离心l 5min；7、弃上清，加入lml 75％的乙醇洗涤RNA沉淀，4"C，75009，离一L,5min；8、干燥RNA，用20tal DEPC水溶解RNA；9、用紫外分光光度计测定RNA的含量，．20℃保存，准备做RT．PCR。

2蛋白浓度测定1）蛋白标准液（用BSA配制）25mg/ml储存液，稀释为0.5mg/ml，稀释步骤：例：10μL 25mg/ml的蛋白标准液＋90μL PBS混合成2.5mg/ml蛋白标准液20μL 2.5mg/ml的蛋白标准液＋80μL PBS混合成0.5mg/ml蛋白标准液2）需设置八个标准孔以绘出标准曲线，采用BCA试剂盒测出蛋白浓度，标准孔设置及所加试剂量如下：试剂蛋白标准液（0.5mg/ml）3）配制BCA蛋白测定液，溶液A：溶液B=50：1先混合均匀，至完全互溶备用4）待测蛋白孔加：2μL蛋白液+18μL PBS，每孔的体积均为20μL5）每孔加180μL配好的BCA蛋白测定液，使每孔总体积均为200μL；6）室温避光放置两个小时或37℃放置30min；7）用酶标仪测出每孔的吸光度，（570nm），测三次；8）用excel工具根据标准孔的数据作散点图，并做出直线及公式。