第八章 柠檬酸循环-2

顺乌头酸酶
柠檬酸是一种前手性分子，然而顺乌头酸酶却能对 柠檬酸两端的两个相同的基团(-CH2-COO－ )具有选择性。 如反应式所指出的，脱水和加水反应只涉及到柠檬酸的下半部分 (即来自草酰乙酸碳原子上的基团)。对这种选择的解释是：根据 酶作用的立体专一性，酶分子活性中心是不对称的，有三个不 同的结合位，这三个不同的结合位只有在与底物分子的三个不同 的取代基互补配对时，该酶才能进行催化。 柠檬酸的中心碳连接有四个取代基，其中两个是相同的 (-CH2-COO－)。但是这两个相同的基团在空间取向上是不同的， 也就是说在空间上是可以区别的。
柠檬酸循环的反应过程
（一）柠檬酸的生成 柠檬酸合酶(citrate synthase)催化乙酰CoA与草酰乙酸的缩 合，生成柠檬酸。这是柠檬酸循环的起始反应。 同位素标记实验表明，乙酰基上的甲基碳与草酰乙酸的羰基碳 结合。柠檬酸合酶催化的反应遵循有序顺序反应机制。由于乙酰 CoA是一种高能化合物，当硫酯键被水解时，可释放出大量的能量 (△Go’= - 32.2 kJ/mol)，因而在细胞内能推动反应向柠檬酸生成 的方向进行。柠檬酸合酶催化的反应是不可逆的，受到多种效应物 的调节。
当柠檬酸与顺乌头酸酶的 活性中心结合时，酶活性中 心的微环境能区别在空间取 向上不同的两个相同的基团， 使得两个相同的基团中只有 一个被酶作用，而另一个则 不能被酶催化。
柠檬酸的中心碳连接有四个取代基，其中两个是相同的 (-CH2-COO－)。但是这两个相同的基团在空间取向上是不同的， 也就是说在空间上是可以区别的。 顺乌头酸酶的这种作用特性就解释了为什么后续的脱羧反应 只发生在与乙酰基参入部位相对的碳位上，而不发生在乙酰基参 入部位这一端。
琥珀酰CoA合成酶催化的反应涉及到CoA被磷酸基取代，在 该酶的活性部位形成琥珀酰基磷酸(succinyl phosphate)。然后， 磷酸基转移到酶活性部位的His残基上，形成磷酸组氨酸，并释 放出琥珀酸；随后磷酸基被转移到GDP上，生成GTP。
在哺乳动物体内，该反应通常合成的是GTP；植 物和细菌的琥珀酰CoA合成酶则通常合成ATP。
在哺乳动物组织中也存在依赖于NADP＋的异柠檬酸脱氢酶。
异柠檬酸脱氢酶的 反应机制
氧化
脱羧
草酰琥珀酸是异柠檬酸 脱氢酶催化反应的中间物， 它只是瞬间存在。但是酶 活性部位的残基(Tyr160和 Lys230)如发生突变，则使 该酶的活性降低(即产生动 力学“瓶颈”)，造成反应 中间物的积累而证实它的 存在。

柠檬酸的合成 has a large negative G and is a site of regulation.

NADH &琥珀酰-CoA are allosteric inhibitors.
Citrate synthase in mammals is a dimer of 49-kD subunits. In the monomer shown here, citrate (blue) and CoA (red) bind to the active site, which lies in a cleft between two domains and is surrounded mainly by α-helical segments.
第二节
柠 檬 酸 循 环
柠檬酸循环(citric acid cycle)是乙酰基二碳单位进一步 氧化降解产生CO2和还原型辅酶的代谢途径。由于该反应顺序是乙 酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸开始的，且草酰乙酸经多步反应 之后重新生成，构成了一个循环反应途径，因此，该循环反应称 为柠檬酸循环。 柠檬酸循环处在物质代谢的中心位置，该途径的发现在生物 化学发展史上占据着重要的位置。
（二）异柠檬酸的形成 柠檬酸在顺乌头酸酶(aconitase)的催化下，异构化转变成异 柠檬酸(isocitrate)。顺乌头酸(cis-aconitate)是这一转变反应 的中间物。该步反应是可逆的，△Go'＝﹢6.3 kJ/mol，反应有利 于柠檬酸。因此，在平衡时，异柠檬酸大约只占10%。
顺乌头酸酶
TCA的前5步反应产生了什么？
（四）
α-酮戊二酸氧化脱羧产生琥珀酰CoA
α-酮戊二酸在α-酮戊二酸脱氢酶复合物的催化 下，氧化脱羧，产生琥珀酰CoA，同时释放出CO2和 NADH。
这里，释放出CO2同样来自原初的草酰乙酸部分 而不是来自乙酰CoA的乙酰基。
α-酮戊二酸脱氢酶复合物催化的反应在化学上与丙酮酸脱 氢酶复合物相似。这个酶复合物也是由三种酶组成： α-酮戊二酸脱氢酶(E1)、 二氢硫辛酰转琥珀酰基酶(E2) 二氢硫辛酰脱氢酶(E3)。 E1和E2作用的底物不同， 这里E3与丙酮酸脱氢酶复合物的E3相同。
1937年，Krebs发现，如果向肌肉组织匀浆液中 加入草酰乙酸和丙酮酸 ( 或者乙酸 ) ，能够合成柠檬 酸。于是，他认为存在着一个循环途径，该途径的 任何一种中间物的加入都能产生所有的其他中间物。 这个循环途径的存在以及丙酮酸与草酰乙酸缩合以 柠檬酸的形式进入到该循环，为琥珀酸、延胡索酸 和苹果酸加速反应的性质提供了解释。如果所有这 些中间物都能导致草酰乙酸的产生，那么它们都能 促进本身以外的许多物质的氧化。
The citrate synthase reaction initiates the TCA cycle
nucleophile attack
med in the citrate synthase reaction from oxaloacetate and acetyl-CoA. The mechanism involves nucleophilic attack by the 乙酰辅酶A 的甲基碳亲核攻击草酰乙酸的羰基碳，硫酯键水解。
（三） 异柠檬酸的氧化脱羧 异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸氧化脱羧转变成α-酮 戊二酸。这是柠檬酸循环的第一步脱羧反应。在该反应中 伴随NAD＋还原产生NADH。 注意，这里脱去的CO2来自原初的草酰乙酸部分，而不 是乙酰CoA的乙酰基部分。
在该酶的催化反应中，异柠檬酸的二级醇羟基氧化， 转变成草酰琥珀酸(oxalosuccinate)，接着β-位羧基发 生脱羧反应，生成α-酮戊二酸。Mn2＋在反应中起着使新 形成的羰基极化的作用。
草酰琥珀酸
α-酮戊二酸
Isocitrate Dehydrogenase Catalyzes the First Oxidative Decarboxylation in the Cycle
The active site of isocitrate dehydrogenase. Isocitrate is shown in blue, NADP+ (as an NAD+ analog) is shown in gold, with Ca2+ in red.
柠檬酸循环的发现
上世纪30年初，Krebs开始研究琥珀酸、柠檬酸等有机酸在组织匀浆液中 可被氧化，并观察到丙酮酸也可转变成草酰乙酸，亦能象其他二羧酸一样被 氧化。 1935年，Szent-Györgyi发现，葡萄糖氧化可被琥珀酸、延胡索酸、苹果 酸或者草酰乙酸显著加速；同时他观察到，任何一种四碳二羧酸都会导致氧 的大量消耗和CO2的产生，远比这些化合物本身直接氧化所预期的要多。他认 为，在细胞内这些物质是有限的，当提供这类物质时，可以刺激内源性葡萄 糖在组织内的氧化。后来进一步发现，丙二酸(琥珀酸脱氢酶的一种竞争性抑 制剂)能抑制这些氧化过程。这一发现提示，琥珀酸的氧化是一个关键的步骤。 因此，他推测，这些二羧酸是由一种酶促反应途径使其相连结，而这些酶促 反应对有氧代谢来说是不可缺少的。 Martius和Knoop发现，柠檬酸可以转变成异柠檬酸，然后转变成α-酮戊 二酸。这一发现是重要的，因为已知α-酮戊二酸可以酶促转变成琥珀酸。这 是一个接合点，它使从柠檬酸到草酰乙酸转变途径变得比较清晰。
琥珀酰CoA合成酶 催化的反应
高能量的中间体
硫脂键 Succinyl-p 磷酸组氨酸
GTP ATP
哺乳动物体产生的GTP在核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase)催化下，可以将它末端的磷酸基转移到ADP 上，生成ATP： GTP ＋ ADP ←→ GDP ＋ ATP
α-酮戊二酸脱氢酶复合物催化的是一个高度放能的反应 (△Go'＝-33 kJ/mol)，反应产生的琥珀酰CoA象乙酰CoA一样， 含有一个高能硫酯键。
如果说，顺乌头酸酶对柠檬酸的两个相同的基 团没有选择性，α-酮戊二酸脱羧反应释放出CO2应有 一半含有放射性标记，但是，实际结果没有。这证 实了顺乌头酸酶具有选择性.
（五）
琥珀酰CoA氧化转变成为琥珀酸
琥珀酰CoA合成酶(succinyl-CoA synthetase)催 化琥珀酰CoA裂解产生琥珀酸，并伴随高能磷酸化合 物(GTP或ATP)的生成。该反应的△Go'约为–2.1 kJ/mol。 这是柠檬酸循环中唯一直接产生高能磷酸化合物 的反应，是底物水平磷酸化的又一个例子。
哪些实验数据能表明是个循环？？？
德国科学家Hans Krebs 在阐明柠 檬酸循环中作出 特殊贡献，1953 年获得诺贝尔医 学奖，柠檬酸循 环又称Krebs循环。
柠檬酸(TCA)循环概 貌
由丙酮酸形成的 乙酰CoA或者是其它 代谢途径（如脂肪 酸或氨基酸的分解 代谢途径）产生的 乙酰CoA可以通过柠 檬酸循环氧化. 柠檬酸循环涉及 八步酶促反应。