植物组织培养结业总结玉米单倍体育种的研究进展姓名：张曦班级：农学 101学号： 1009010070指导老师：张素勤玉米单倍体育种的研究进展摘要: 阐述了玉米单倍体育种技术研究进展及在玉米育种中的应用。
包括玉米单倍体的获得方法、鉴定方法、二倍体加倍方法、在玉米育种中的应用等,重点阐述了加倍方法和基础材料的选择，指出单倍体育种应注意的几个问题，并提出单倍体育种技术发展前景。
关键词:玉米；育种；单倍体；二倍体加倍随着人口的增加和经济的发展，玉米的需求量不断上涨。
耕地面积减少和环境的恶化使人们对高产、优质、抗逆性强的玉米新品种需求日益迫切。
而目前用常规育种方法获得高配合力的纯合自交系需耗费大量的人力和时间。
常规的育种技术已经越来越不能满足人们的育种需求。
近年来，单倍体育种技术、基因工程育种、分子标记辅助育种等生物技术手段的发展提高了育种效率，开辟了玉米育种的新途径。
单倍体技术选育玉米自交系在国外已经广泛使用，目前国外大约60%的马齿型自交系， 30%的硬粒型自交系由单倍体技术选育出来。
在我国最早开展此项研究的是中国科学院遗传所，通过孤雌生殖技术，在不到20年里育成3000 多个孤雌生殖纯系，其中综合性状优良或个别性状突出，可直接或者间接用于育种的近350个。
此外近几年中国农业大学、华中农业大学、河北农业大学、吉林省农业科学院、山东省农业科学院和辽宁省农业科学院等也都先后从事了这方面的研究，目前也都育成了多个性状较优良的DH系，并且选育出多个优良组合参加国家级和省级区域试验，遗单6号、科玉10号、秦单5号已通过审定，并在生产上进行推广。
一、单倍体的发现单倍体是指只携有配子染色体数目的个体，自然界中的单倍体是经过不正常受精形成的，一般发生频率很低。
1922年，Dorothy Bergner 首次发现了野生的曼陀罗单倍体，此后，烟草、小麦等其他物种的单倍体被相继发现。
玉米单倍体的发现相对较晚，Randolph首先观察到品种间或自交系间杂交的后代中有0.011%～0.103%的孤雌生殖单倍体，并且不同杂交组合中单倍体产生的频率存在较大的差异。
尽管单倍体的发现较早，但人工单倍体的产生经历了漫长的过程。
直到1964年，Guha和Maheshwari使用花药培养，第一次在实验室得到了人工的曼陀罗单倍体。
二、获得玉米单倍体技术1.1 自然发生的单倍体生殖过程异常所引起的孤雌或孤雄生殖而来的玉米单倍体,自然发生的单倍体的频率极低,仅为10-5～10- 8。
由于单倍体高度不育,其植株和它的组织器官等都比它们的二倍体弱小,所以自然界中存在的单倍体很少。
1.2 孤雌生殖诱导玉米孤雌生殖的方法很多。
利用异种花粉授粉, 刺激未受精卵发育引起孤雌生殖产生单倍体；利用紫外线处理的玉米成熟花粉粒给正常植株授粉, 让已无授精能力的花粉去刺激未受精的卵细胞单性发育成单倍体的胚；利用甲苯胺蓝等化学药剂处理花粉产生单倍体。
化学药物诱导孤雌生殖常易产生一些影响生理生化和形态上的畸变, 其可靠性常受到怀疑。
1.3 花粉、花药培养用花药、花粉组织培养技术获得单倍体。
在获得单倍体的同时，还常常出现已自然加倍了的二倍体和双倍体。
1.4 传粉玉米子房诱导单倍体利用花粉的生物刺激作用来诱导传粉的玉米子房产生单倍体植株, 可建立起高效、稳定的玉米单倍体诱导体系。
汤飞宇(2004)等研究了授粉时间长短和季节对单倍体诱导效果的影响研究。
结果表明: 当授粉时间控制在12～22 h, 授粉子房均有可能诱导出单倍体植株，春秋季诱导单倍体植株的效果比夏季好。
从26400个子房中获得281株再生植株, 经根尖压片检查其中24 株为单倍体植株, 证明了利用传粉植株诱导单倍体植株是可行的。
利用传粉的玉米子房来诱导单倍体植株, 有助于启动卵细胞单性胚胎发育。
玉米子房传粉15h 即有可能被诱导出单倍体植株, 如授粉时间延长, 会增加子房授精的危险, 因此利用传粉玉米子房来诱导产生单倍体植株, 关键在于控制好授粉时间。
1.5 远缘杂交单亲染色体消失在远缘杂交中, 可能由于双亲体细胞分裂周期的不同步, 导致某一亲本染色体的丢失, 从而引起单倍体的发生。
1.6 辐射诱导用射线照射花或父本花粉经X射线处理后, 给去雄的母本授粉, 以影响授精, 诱导单性生殖产生单倍体。
1.7 利用高频诱导单倍体材料美国发现了一个高频诱导单倍体的材料并定名为Stock6, 为早熟、白色、粉质、硬粒型的玉米, 后又经过两次回交和两次自交导入了控制子粒性状和植株性状的两种显性标记基因。
它具有两个标记性状: 子粒有斑纹、成株叶片和叶鞘呈紫色, 均是由互补基因控制。
Stock6诱导产生单倍体的原理已经清楚, 双授精过程中一个精子与极核结合, 而另一个精子不能与卵结合形成授精卵。
在育种实践中用作父本, 被诱导的育种试材作母本, 大约有3%的单倍体胚。
此外还有A358、ZMS、MKS、MHI 等一些单倍体诱导材料, 均能够产生大约3%的单倍体胚。
在以上这些材料中, 目前利用较多的是Stock6, 育种家已利用作父本诱导了大量的母本单倍体, 从中获得的部分玉米自交系已在生产上加以利用。
张铭堂(1992)用Stock6 作父本, 诱导单交种OH43×Mo17, 共获得600个杂交果穗计305100粒种子, 经子粒标记选择和植株标记选择, 最后获得249个双单倍体纯系, 现已育成2个玉米自交系, 并配出优良的商业杂交种。
刘纪麟(2001)从美国引进了玉米诱导系Stock6, 并用它作父本对WBM、辽旅等6个玉米群体进行了单倍体诱导, 经对诱导后代的子粒、成株标记和植株育性的鉴定, 已获得一些双单倍体材料。
三、单倍体加倍方法3.1 单倍体的自然加倍在自然生长环境中，单倍体植株各组织的体细胞发生自然加倍的现象比较普遍。
玉米单倍体植株自然加倍的概率为0.4%～1.2%，但自然加倍率受环境与基因型的影响，不同的基因型自然加倍的频率差异较大，有的材料不发生自然加倍，有的材料自然加倍率达10%。
通常情况下，玉米单倍体植株表现为不育和雌雄不协调，而雄穗的育性是自然加倍的关键。
对于自然加倍率高的材料，依靠自身的育性恢复便可以自交结实；而对于自然加倍率低的材料，对其进行人工加倍就显得十分必要。
3.2 单倍体的人工加倍单倍体人工加倍的方法较多，玉米单倍体常用的方法有浸种法、浸芽法、注射法、组织培养加倍法、气体加倍法等。
刘志增、宋同明使用注射法在6叶期和拔节期分别注射不同浓度的秋水仙素溶液，结果发现，注射0.05%和0.1%的秋水仙素溶液，在拔节期的散粉率分别是2.86%和5.71%；而6 叶期的散粉率分别是18.52%和23.08%，显著高于拔节期的加倍效果。
魏俊杰等也进行了相关的研究，结果表明在6叶期的注射效果显著高于拔节期。
文科等使用秋水仙素溶液，以不同的加倍方法进行了对比研究，结果发现，浸根法和注射法对植株的伤害比较严重，浸种法和注射法的散粉率和结实率较高，浸种法的加倍效果较好，注射法次之。
3.3 组织培养加倍技术组织培养加倍的方法是将秋水仙素、除草剂或其他试剂添加到培养基中，对花药、小孢子或单倍体愈伤组织等进行加倍处理，然后经分化得到DH植株的方法。
Wan等用0.05%和0.025%秋水仙素分别处理单倍体愈伤组织24、48、72h，结果发现，处理72h加倍效果较好，136株再生植株中有107株自交结实。
Saisingtong等在诱导培养基中添加5～1000 mg/L的秋水仙素，研究发现，低浓度的秋水仙素(5mg/L)长时间处理(7d)或高浓度秋水仙素(250mg/L)短时间处理(1～3d)有利于花药胚状体结构的形成。
秋水仙素浓度越高加倍效果越好，但高浓度的秋水仙素抑制植株的分化再生。
Barnabás等用0.02%和0.03%的秋水仙素处理玉米小孢子，得到了高度可育的再生植株[37]。
由于秋水仙素是致癌物质，对身体健康影响较大，因此科研工作者试图寻找一种既对人体安全、同时加倍率又高的替代品。
在随后的研究表明，除草剂是代替秋水仙素的理想选择。
Wan 等使用amiprophosmethyl(APM、pronamide、oryzalin和trifluralin4种除草剂处理玉米花药单倍体愈伤组织，结果表明，10μmol/LAPM和10μmol/Lpronamide 对单倍体愈伤组织的生长和分化抑制作用小，加倍率高；oryzalin 加倍效果好，但严重抑制愈伤组织的生长和再生植株的分化；低浓度的trifluralin加倍效果较差，高浓度又对愈伤组织的生长和再生植株的分化有较强的抑制作用。
David 等对月季、马铃薯、冬青、芒草、甜菜、小麦等也报道了除草剂加倍成功的研究。
3.4 气体加倍法在玉米6叶期，用一氧化二氮气体(600kPa)处理2d，可以显著提高单倍体植株的可育性，44%的单倍体植株能自交结实；没有用一氧化二氮气体处理的单倍体，只有11%的单倍体植株能自发加倍。
四、单倍体在玉米育种中的应用利用单倍体技术可缩短培育优势杂种时间, 克服远缘杂交产生的不亲合性、提高诱变育种的效率、合成玉米育种新材料。
单倍体技术培育玉米自交系在美国正被玉米商业育种家广泛地利用。
在我国, 最早开展此项研究的中国科学院遗传研究所, 通过采用孤雌生殖技术, 在不到20年的时间里已育成3000多个孤雌生殖纯系, 其中综合性状优良或个别性状突出, 可直接或间接用于育种的近350个, 选出多个优良组合参加省级和国家级区试。
遗单6号、科玉10 号、秦单5号已通过审定, 并在生产上进行推广。
五、玉米单倍体育种的前景单倍体技术在玉米育种上应用具有如下优点:快速获得纯系; 在单倍体中能简化基因互作, 去掉超显性效应, 保留有利的加性和加性上位效应; 还可淘汰有害的、致死和半致死的隐性基因。
但是, 单倍体育种技术也存在缺点: 不能有效打破不良基因的连锁; 基因间的重组几率较低; 单倍体的诱导频率不高。
此外, 重组二倍体时染色体加倍具有一定的困难。
目前, 二倍体化的频率能达到15%～25%。
随着对单倍体现象的深入研究和科技进步, 这些限制因素被最大限度地克服了, 形成了一种新的育种思路- - 分解育种(梁文科,2004)。
分解育种包括3个阶段: 获得单倍体; 在单倍体水平上进行选育; 多倍体的重新合成。
而单倍体的获得是分解育种的基础, 利用单倍体技术获得纯系是分解育种的重要研究方向之一。
对玉米而言, 分解育种方案简化为两个阶段: 即获得单倍体和单倍体的二倍体化。
提出利用单倍体技术获取玉米自交系: 利用自然发生或人工培育的单倍体植株, 经过自然或人工加倍获得双单倍体和纯系。
因为从单倍体到纯系只需一个世代, 并且单倍体技术的应用是对配子进行选择, 获得优良的遗传重组的机会高于合子的选择, 并可缩短自交系的选育年限, 提高育种效率。
