凯氏定氮法与三聚氰胺事件---教案(冯应斌)

凯氏定氮实验的原理与操作方法测定原理待测天然含氮有机物与浓硫酸共热时，被氧化成为二氧化碳和水，而氮转变成氨，氨再与硫酸结合生成硫酸铵。

为了加速有机物质的分解反应，在消化时常加入促进剂，硫酸铜可用作催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点，氧化剂如过氧化氢也能加速反应。

操作方法样品处理测定某一固体样品中蛋白质的含量都是按100克物质的干重中所含蛋白质的克数来表示。

因此在定氮前应先将固体样品中的水分除去。

步骤：先将样品磨细，在已称重的称量瓶中称入一定量样品，然后置105度（100度无法除去非游离水）的烘箱内干燥2小时后称重，以后每1小时再称重，直至2次称重数不变为止。

若样品属于液体物质，可取一定体积经适当稀释后，取一定量进行消化。

消化根据样品量的多少选择适宜的凯氏烧瓶4个（此处以50毫升为例），其中2个为对照。

向烧瓶内加入准确称量的样品，注意要把样品加至烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。

另外2个作空白对照，好对样品进行校正。

在每个烧瓶中加入约300毫克硫酸钾-硫酸铜混合物（硫酸钾：五水硫酸铜=3：1、6：1或10：1均可），再用量筒加入3毫升浓硫酸。

将上述4个凯氏烧瓶放在通风良好处（最好在通风橱中进行）加热消化。

先用小火加热至沸腾。

此时会产生大量泡沫，应特别注意不能让黑色物质上升到烧瓶颈部，否则将严重影响分析结果。

当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化硫也均匀地放出时，将火焰调节到保持瓶内液体微微沸腾。

假若发现瓶颈上有黑色颗粒，应小心地将烧瓶倾斜振摇，用消化液将其洗下。

在消化过程中要时常转动烧瓶，使全部样品都浸在消化液中。

当消化液呈清澈淡蓝色时即告消化结束。

时间一般在5~6小时！若样品中含赖氨酸或组氨酸较多时，消化时间需要延长1~2倍。

因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全。

蒸馏采用改良式凯氏定氮仪。

1、洗涤蒸馏仪：用硼酸指示剂（取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示剂约1毫升，摇匀后呈紫红色即可；混合指示剂：50毫升0.1%甲烯蓝乙醇+200毫升0.1%甲基红乙醇，存于棕色瓶中）检测是否清洗干净。

《凯氏定氮法与三聚氰胺事件》教案主讲：冯应斌一、教学目标了解三聚氰胺事件掌握凯氏定氮法的基本原理、基本操作了解相关新标准、新技术二、重点、难点凯氏定氮法的基本原理、基本操作三、教学方法启发式教学、讲授法与演示法结合四、教学用具多媒体五、教学过程导入：蛋白质是重要的食品营养物质之一，被称作最重要的生命物质，是构成生命体的主要物质，参与物质代谢，提供能量，食品中的蛋白质含量直接反应食品制品的质量，食品中蛋白质含量的测定一直是食品检测的重要指标之一，对于牛奶制品来说，蛋白质含量的多少更是重要的质量依据。

去年的三鹿奶粉三聚氰胺事件，相信大家都还印象深刻，那么，在讲本节主要内容之前，让我们再回顾一下08年震惊全球的三聚氰胺事件。

（播放相关视频）三聚氰胺事件的发生，与我国食品中蛋白质含量的测定方法——凯氏定氮法有很大关系，那么，凯氏定氮法是怎样的一种测定方法呢？讲授：蛋白质的定量测定——凯氏定氮法，由1883年由Kieldahl首先提出，经过长期不断改进成为世界各国普遍采用的标准方法。

可用于所有动植物食品的蛋白质含量测定，不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。

（一）原理：食品样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4反应式为：2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04（其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3（二）操作方法（联系视频进行讲解）1、样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。

凯氏定氮法原理，方法步骤和计算方法（三少整理版）三鹿奶粉事件让全国人民知道了三聚氰胺，食品中蛋白质含量的现行国家标准和国际通行测定方法是经典凯氏定氮法，三少作为一名分析人员，现在将凯氏定氮法原理，方法步骤和计算方法写出来，看看凯氏定氮法在蛋白质含量中的缺陷。

何为凯氏定氮法？简单地说，凯氏定氮法是一种检测物质中“氮的含量”的方法。

蛋白质是一种含氮的有机化合物，食品中的蛋白质经硫酸和催化剂分解后，产生的氨能够与硫酸结合，生成硫酸氨，再经过碱化蒸馏后，氨即成为游离状态，游离氨经硼酸吸引，再以硫酸或盐酸的标准溶液进行滴定，根据酸的消耗量再乘以换算系数，就可以推算出食品中的蛋白含量。

一. [凯氏定氮法原理]凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。

为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。

硫酸铜起催化剂的作用。

凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。

使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。

消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。

滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。

在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。

测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。

反应式如下：1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4反应式为：H2SO4==SO2+H2O+[O]R. CH.COOH+[O]==R.CO.COOH+NH3NH3R.CO.COOH+[O]==nCO2+mH2O2NH3+H2SO4==(NH4)2SO42.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中反应式为：2NH4++OH-==NH3+H2ONH3+H3BO3==NH4++H2BO3-3. 再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。