悬浮细胞的传代培养

6叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。

答：（一）悬浮生长细胞的传代：有以下两种方法：
1、直接传代法：①悬浮细胞自然沉淀瓶底；②用吸管吸去上清1/2～2/3；③轻轻吹打成细胞悬液；④等分装入数个培养瓶（皿）
2、离心传代法：①将细胞悬液转移到离心管内；②800～1000r/min离心5min，弃上清；③加新的培养液到离心管内；④吸管吹打成为细胞悬液；⑤分瓶（皿）培养。

（二）半贴壁细胞和贴壁细胞的传代：采用消化法。

消化液是：0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA、二者混合液、最好在37℃或室温（25℃以上）环境进行。

其操作步骤（以25ml培养瓶为例）: （1）弃去旧培养液；（2）漂洗：加入2mll 无Ca2+、Mg2+的PBS，漂洗1次后倒掉；（3）消化：加入消化液，使之铺满细胞表面（待肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，残液继续作用2~3min，轻轻摇动，细胞层可随残液呈片状脱落下来，显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时立即终止消化）；（4）吹打：加入完全培养基5mll，用吸管按顺序进行反复吹打瓶壁，吹打时不要用力过大。

（5）调整至合适细胞浓度，分瓶培养。

贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
首先，在细胞生长形态上，贴壁细胞通常呈现典型的单层或多层附着
细胞的形态，细胞扩张生长速度较慢，细胞形态变化较小。

而悬浮细胞则
以单个细胞或细胞集合体的形式存在于液体培养基中，生长速度较快，细
胞形态较为多样化。

其次，在培养条件上，贴壁细胞需要在培养基中添加黏附分子或包袋
来增加其附着能力，以保持细胞在培养皿底部的黏附和生长。

而悬浮细胞
则需要在培养基中添加抗聚集剂或搅拌设备来避免细胞结块，以保持细胞
的均匀悬浮和生长。

再次，在传代方法上，贴壁细胞传代通常采用单层脱离法或酶消化法。

单层脱离法利用细胞与培养皿表面的非共价键结合进行脱离，可通过物理
刮擦或液体冲击等方法将细胞从培养皿上收集下来。

酶消化法则通过加入
蛋白酶等酶类物质分解黏附细胞与基质之间的胶原纤维等结构，使细胞能
够从培养皿表面脱离。

而悬浮细胞传代则更为简单，通常只需要将培养基
中的细胞离心沉淀后，将上清液中的细胞重新悬浮于新的培养基中即可。

此外，在培养基的选择上，贴壁细胞通常需要使用固体培养基，例如
含有胶原蛋白、明胶或滤纸等的培养基。

而悬浮细胞则需要使用液体培养基，例如含有血清或植物基因表达培养基等。

最后，在细胞应用方面，贴壁细胞通常用于细胞粘附、增殖和分化等
研究领域，如肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞等。

而悬浮细胞则常用于
细胞悬浮培养、蛋白质表达和病毒培养等研究领域，如白细胞、骨髓细胞
和病毒感染细胞等。

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悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。

进一步掌握细胞培养的操作技术。

实验原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。

为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。

实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架（四）其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪（五）试剂1640培养液、PBS操作步骤：1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。

从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。

2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。

3.首先观察培养板孔中培养液量。

用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。

再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。

4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。

5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。

吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。

6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。

7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。

8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。

9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。

二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。

一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。

原代和传代细胞的培养和维持一、原代细胞的培养与维持1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%．在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。

贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。

其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。

2、悬浮细胞的培养凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞．若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。

悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式．二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture)这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。

每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。

传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。

应注意如下几点：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。

(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。

悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。

进一步掌握细胞培养的操作技术。

实验原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。

为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。

实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架（四）其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪（五）试剂1640培养液、PBS操作步骤：1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。

从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。

2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。

3.首先观察培养板孔中培养液量。

用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。

再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。

4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。

5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。

吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。

6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。

7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。

8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。

9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。

二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。

一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。

贴壁细胞：弃去培养液，加胰酶消化，加培养液终止胰酶作用，吹打成悬液，分装传代。

由于贴壁细胞贴壁生长，接触抑制，长满一瓶后贴壁较紧，不易取出。

这时必须用胰蛋白酶或者胶原蛋白酶处理，使其分散开后取出，然后在放入新的培养瓶中培养。

悬浮细胞：离心，弃上清液，加新鲜培养基，分装传代。

悬浮细胞其实也有贴壁现象，只是贴壁不牢。

可以直接用吹打发是细胞掉落下来，进行传代。

传代培养中的细胞传代培养（subculture），当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。

此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。

这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。

对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

传代方法1．悬浮生长细胞传代传代培养中的细胞离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。

2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。

3．贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。

常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

培养材料1、无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,GibcoBRL21600-010)传代培养中的细胞2、trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：以10ml分装于15ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。

3、新鲜培养基4、无菌吸管/离心管/培养瓶编辑本段培养步骤1、附着型胞(adherentcell)（1）吸掉旧培养液。

THP1细胞复苏传代以及冻存步骤
一,复苏
1,将液氮中冻存细胞拿出，迅速放在37℃水浴锅1-2min至融化。

2,1640培养液提前放入37℃,用1640培养基6ml左右洗涤一次，注意吹打使细胞分散，然后300g（rcf）5min离心（活细胞最大1400g）3,弃掉上清，用6ml左右培养基重悬。

4,加入到T25培养瓶，镜下观察细胞状态。

5,悬浮细胞竖立放入温箱。

二，传代（传代两次以上再用于后续实验）
1,镜下观察细胞密度，计数板计数，确定稀释倍数。

2,300g（rcf）5min离心，去除培养液。

3,加入适量预热的培养基，制成10^5个细胞/ml 的细胞悬液。

4,分装到2-3个新培养基，将其放入培养箱，24h观察一次（变黄了就传一次，2d左右）
三,冻存细胞
1，离心弃上清，用冻存液（领商品化试剂或者领血清，DMSO等配制），1ml左右混匀，注意避免气泡。

2,商品化的先放进-80℃，4h左右，再放入液氮罐，自己配制的要缓冻，先将-80℃盒子拿出来平衡，然后放入-80℃过夜，然后放液氮，或者在4℃，-20℃，-80℃依次放4h，然后转入液氮。