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动物细胞工程知识点总结动物细胞工程是一门综合性的学科，主要研究分子生物学、细胞生物学、生物工程学等方面的知识，旨在利用现代生物技术，对动物细胞进行精细的操作和调控，实现生物制品的高效生产和治疗的有效手段。
动物细胞工程的主要内容包括：细胞培养、基因修饰、蛋白质表达、生物传感、干细胞研究、组织工程、基因治疗等等。
其中，细胞培养是动物细胞工程的基础和核心，是实现其他学科研究的前提和保障。
细胞培养技术涉及多种类型的细胞，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、鸟类细胞等。
常见的细胞培养方式有两种：悬浮培养和贴壁培养。
对于悬浮培养的细胞，需要在旋转式生物发酵罐或气泡式生物反应器中进行培养，而贴壁培养的细胞则需要一定的基础培养物和培养基来维持其生长和分化。
在细胞培养基础上，基因修饰技术可以通过外源DNA的导入或内源DNA的编辑，实现对目标细胞的基因表达的精准调控。
此外，蛋白质表达技术也是动物细胞工程的重要内容，可通过转染、转化或质粒转移等方式，将外源基因表达特定的蛋白质，实现蛋白质的高效合成和分泌。
生物传感技术是近年来兴起的一个领域，研究通过特定的生物材料或生物反应器件，实现对生物大分子的定量检测和分析，有望实现临床诊断的快速、准确、便捷化。
干细胞研究是动物细胞工程的前沿领域，主要研究人类和动物的干细胞的分化和再生能力，为组织工程、再生医学等领域提供基础和支持。
组织工程技术是一种将干细胞和生物材料结合起来，制作出复杂的组织器官或人工器官的新兴技术。
目前研究较为广泛的组织工程重要领域包括人工骨、人工关节、人工角膜等。
基因治疗技术则是动物细胞工程的又一重要领域，通过应用基因编辑、载体输送等技术，实现基因和细胞的治疗效果，是目前治疗癌症、糖尿病、血友病等疾病的新希望。
总之，动物细胞工程在医学、生物科学、生物工程等各个领域有着广泛的应用和重要作用，它的发展有助于图谱生命科学的未来，为人类的健康事业和生物科学的发展做出新的贡献。
![[整理].动物细胞培养技术](https://img.taocdn.com/s1/m/ab808c68a36925c52cc58bd63186bceb19e8ed04.png)
[整理].动物细胞培养技术动物细胞培养技术绪论部分1）细胞的基本概念：细胞（包括单个个体）在体外条件下的⽣长，成为细胞培养。
2）组织培养：其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内⽣理环境，在⽆菌，适当温度和⼀定营养条件下使之⽣存和⽣长并维持其结构和功能的⽅法。
（组织培养从⼴义上说分为动物组织营养和植物组织营养两⼤类。
）组织培养常⽤术语贴壁依赖性：为细胞需贴附于第五或⽀撑物上才能⽣长的性质。
细胞⼀代时间：单个细胞连续两次分裂的时间相隔，可借助显微电影照相术来精确确定。
群体倍增时间：在对数⽣长期进⾏计算的细胞增加⼀倍所需时间。
克隆;单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。
原代培养：从体内取出细胞或组织的第⼀次培养。
传代或传代培养：不论是否稀释，将细胞从⼀个培养瓶转移或移植到另⼀个培养瓶。
细胞杂交：两个或多个不同的细胞融合导致⼀个含核体的形成。
细胞培养：其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内⽣理环境，在⽆菌、适当温度和⼀定营养条件下，使之⽣存和⽣长并维持其结构和功能的⽅法。
细胞培养的作⽤：在病毒学上的作⽤（病毒的分离细胞培养在药物学上的作⽤（新药的制备、药效的鉴别、病毒疫苗的⽣产、单抗的制备）；细胞培养在肿瘤学研究上的作⽤（例如化疗中的药物使⽤剂量、癌症研究等）细胞培养在细胞功能与分化研究中的应⽤；细胞培养在免疫学中的应⽤1)Harrison⾸先解剖出蛙胚原始脊髓节段进⾏培养。
哈⾥森悬滴培养法。
建⽴起⼀套合理的⽆菌操作技术。
（淋巴）⼀般皆公认Harrison为“组织培养之⽗”，凹玻⽚悬滴制备培养技术，对⽣物学知识的研究做出⼗分重要贡献。
2) Carrel 反复传代的⽅法使细胞系存活34年。
他采⽤的⽆菌技术，以及后来设计的培养瓶(卡⽒瓶，Carrel flask)等都是对组织培养的重要贡献。
特别是他的连续培养，为后来的传代培养奠定了基础。
30年代传⼊我国，50年代逐渐发展细胞培养设施和基本条件（⼀）细胞实验室基本原则：防⽌微⽣物污染和有害物的影响。
动物细胞培养技术动物细胞培养技术是生物学领域中的一项重要技术，它可以帮助科学家们研究动物细胞的结构、功能和生理过程。
通过培养动物细胞，科学家可以模拟生物体内的生理环境，从而更好地理解细胞的生物学特性。
本文将介绍动物细胞培养的基本原理和常用的培养技术。
一、动物细胞培养的基本原理动物细胞培养是指将动物体内的细胞取出并在体外特定的培养基中进行培养的过程。
培养基是一种模拟生物体内环境的营养液，它提供了细胞所需的必要营养物质和生长因子。
在培养基中，细胞可以获得适当的营养和生长条件，从而保持其生物学特性并进行增殖。
动物细胞培养的基本原理包括以下几点：1. 细胞来源：细胞可以来源于动物组织、器官或体液中，常用的细胞来源包括胎儿组织、胚胎组织、肿瘤组织等。
2. 细胞分离：细胞从组织中分离的方法通常包括机械分离、化学分离和酶解分离。
分离后的细胞可通过离心等方式得到单个的细胞悬液。
3. 培养基选择：根据细胞的特性和要求，选择合适的培养基。
培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基，无血清培养基常用于细胞实验室中。
4. 细胞培养条件：通过调整培养温度、湿度、pH值、氧气含量等条件，提供合适的环境促进细胞的生长和增殖。
5. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，需要进行细胞传代以保持其活力。
传代的方法通常是将细胞分散至新的培养容器中，以维持细胞的适宜密度。
二、常用的1. 无血清培养技术：无血清培养基是一种不含胎牛血清的培养基，通过添加人工合成的生长因子和营养物质来满足细胞的生长需求。
无血清培养技术避免了胎牛血清中含有的未知因子对实验结果的干扰，提高了实验的可重复性。
2. 原代细胞培养技术：原代细胞培养是将从动物体内直接获得的组织进行分离和培养。
这种方法可用于细胞的初次培养和研究。
但由于原代细胞在培养中只能进行有限的传代，其使用寿命较短，因此需要定期重新取材。
3. 细胞系的建立：细胞系是细胞通过传代培养，并保持了一定生物学特性和遗传稳定性的细胞群。
《动物细胞培养技术及其应用》知识清单一、动物细胞培养技术的基本概念动物细胞培养，简单来说，就是在体外模拟体内的环境，让动物细胞生长和繁殖的一种技术。
这可不是把细胞随便放在一个容器里就完事，而是需要一系列严格的条件和操作。
要进行动物细胞培养，首先得有细胞来源。
这通常来自动物的组织或器官，通过一些特殊的处理方法，把细胞分离出来。
然后，把这些细胞放进一个专门设计的培养容器中，里面有细胞生长所需的营养物质、生长因子、气体环境（比如氧气和二氧化碳），还有合适的温度、酸碱度等条件。
二、动物细胞培养的基本条件1、无菌环境这可是重中之重！哪怕有一点点细菌、真菌或者病毒混入，都可能让整个培养失败。
所以，实验室的设备要严格消毒，操作过程也要在无菌的条件下进行。
2、合适的营养细胞要生长，就像我们人要吃饭一样，得给它们提供足够的营养。
这包括各种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等。
而且，不同类型的细胞，对营养的需求还不太一样，得“因材施教”。
3、适宜的温度和酸碱度一般来说，动物细胞培养的温度在 365 到 375 摄氏度之间，酸碱度则通常维持在 pH 72 到 74 左右。
如果温度或酸碱度不合适，细胞可能会“闹脾气”，甚至死亡。
4、气体环境细胞也需要呼吸，氧气是必不可少的，一般通过培养容器中的通气装置来提供。
同时，二氧化碳对于维持酸碱度也很重要。
三、动物细胞培养的主要步骤1、取材从动物的组织或器官中取出需要培养的细胞。
这一步要尽量减少对细胞的损伤，还要保证细胞的活性。
2、原代培养把刚取出的细胞直接进行培养，这叫原代培养。
这时候的细胞还比较“娇嫩”，需要特别小心呵护。
3、传代培养当原代培养的细胞长满培养容器后，就需要把它们分成小份，转移到新的培养容器中继续培养，这就是传代培养。
4、细胞的冻存与复苏有时候为了长期保存细胞，会把细胞冻存起来。
等需要的时候，再通过特殊的方法让它们复苏，重新恢复生长和繁殖的能力。
四、动物细胞培养技术的应用1、生物制药这可是个大热门！通过培养动物细胞，可以生产出各种生物制品，比如疫苗、抗体、蛋白质药物等。
动物细胞培养·心得在学习动物细胞培养的过程中，我了解到是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础点，细胞培养是生物医学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。
在这次PPT 制作中，我对无脊椎动物和脊椎动物两大领域细胞培养取得的进展及应用作了较为详细的了解，并在此基础上探讨了动物细胞培养存在的问题以及未来的发展方向。
为相关领域研究者探讨其他种类细胞系的建立及筛选合适的细胞系培养方法作为理论的参考依据我了解到历史上组织培养技术创建于 18 世纪末，之后于 1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从体内组织取出细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。
这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。
特别是随着近年来现代生物科学领域的迅速拓展，各种分子生物学实验诸如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。
然而，在种类繁多的动物世界里，细胞培养实验技术的发展并不均衡，构建动物细胞培养体系的研究效率和效果上也存在较大的局限性。
而动物细胞培养，在1907年，哈里森（Harrison）在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。
之后，又有人将悬滴培养法改良为双盖片培养，提高了传代效率并减少了污染；1923年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。
1951年，厄尔（Earle）发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。
1951年，波米拉（Pomerat）设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中，便于作显微摄影和细胞代谢的研究。
《动物细胞培养》一节教学设计及实践反思导读：学校每学期每位老师都有一节校内公开课。
本学期我选择了《2.2.1动物细胞培养和核移植技术（第一课时）》即《动物细胞培养》作为公开课即录像课的教学内容。
在课前经过了自己精心准备但是具体实施的教学结果却不令人满意。
通过“有效上课”专题的学习研究，我认真反思了自己这节课不成功的原因，与大家交流。
说明：第一部分公开课时《动物细胞培养》的教学设计第二部分课后的几点教学反思第三部分反思后的《动物细胞培养》教学设计一、教学目标简述动物细胞培养的过程、条件及应用。
二、教学重点、难点1. 教学重点动物细胞培养的过程及条件。
2. 教学难点动物细胞培养的过程及条件三、教材分析动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
在动物细胞培养技术之后介绍的核移植技术、动物细胞融合技术、生产单克隆抗体以及胚胎工程都要用到动物细胞培养技术。
掌握好这项技术才能为其他技术打好铺垫。
所以把动物细胞培养讲的清清楚楚、明明白白就十分重要了。
在动物细胞培养的教学中，可把这部分内容归纳成三个问题：（1）为什么要进行动物细胞的培养？——即培养的用途（2）什么是动物细胞的培养？（3）怎样进行动物细胞的培养？第三个问题是本节课的重点。
四、学情分析动物细胞在体内的增殖学生是了解的，在体外如何实现细胞增殖的，有什么特点以及培养后的细胞有什么用途都是可以激发学生的学习兴趣。
对于动物细胞培养的条件，则要从学生已有的内环境的知识出发，启发学生自己动脑思考这个问题，以加深对培养条件的理解。
学习了植物细胞工程的基础上再去联系动物细胞培养技术，并能作出二者的比较。
五、教学过程（我将本节所以设置的问题或问题组或活动编号）5.1课堂导入：师展示两幅烧伤程度不同的病人图片。
提问如何治疗呢？生答。
师进一步提问：如何获得大量健康的自体皮肤来治疗？生答。
5.2新知学习师：通过培养皮肤细胞可获得健康皮肤细胞，那么什么是动物细胞培养?培养过程有什么特点以及培养的细胞用途有哪些呢？本节课一起来解决？师展示图片:动物细胞培养的概念。
专题2 细胞工程 2.3 动物细胞工程知识点汇总1. 动物细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。
细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
（4）动物细胞培养需要满足以下条件①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。
通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。
此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。
通常需加入血清、血浆等天然成分。
③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃+0.5℃；pH：7.2～7.4。
④气体环境：95%空气+5%CO2。
O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。
2.动物体细胞核移植技术和克隆动物（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。
（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。
（3）体细胞核移植的大致过程是：高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养；同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞，去核（显微操作）（注：为什么要用卵细胞？它可以提供充足的营养；操作简便；细胞质不会抑制细胞核全能性的表达）；将供体细胞注入去核卵母细胞；通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎；将胚胎移入受体（代孕）母牛体内；生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛。
动物细胞培养总结动物细胞培养的基本步骤包括细胞分离、种植、培养及维护。
首先需要从动物组织中获取细胞，可以通过机械或酶解的方式将组织细胞分离出来。
然后将细胞悬浮液转移到培养皿中，加入适当的培养基，并提供适宜的温度、湿度和气体环境。
细胞在培养皿中会逐渐形成单层或悬浮状态，可以进行细胞形态观察、增殖和鉴定等。
维护细胞的正常生长和增殖，需要定期更换培养基并进行细胞传代，以避免细胞的老化和死亡。
动物细胞培养的关键因素包括细胞种类的选择、培养基的配制、环境参数的控制等。
细胞种类的选择应根据研究需求和细胞特性进行，不同的细胞对培养条件的要求有所差异。
培养基是细胞培养的基础，需要提供充足的营养物质、生长因子和激素等，以满足细胞正常生长和增殖所需。
同时，培养基的pH值、温度和湿度等环境参数也需要严格控制，以维持细胞的健康状态。
细胞培养的应用非常广泛。
首先，动物细胞培养可用于细胞生物学研究，如细胞分化、增殖、凋亡等的机制研究。
通过观察细胞在不同条件下的变化，可以揭示细胞生物学过程中的分子机制。
其次，动物细胞培养在生物医学研究中也有重要应用。
例如，用于评估药物的毒性和疗效，开发新的药物或疫苗，以及研究疾病的发生机制等。
此外，动物细胞培养还可用于生产重组蛋白和细胞疫苗等生物制剂，具有重要的经济价值。
在动物细胞培养中，不可避免地会面临一些挑战和困难。
首先，细胞的质量和纯度是细胞培养成功的关键因素之一、细胞分离和培养的过程中，可能会产生细胞杂交和污染，对细胞的准确鉴定和纯度检测提出了要求。
其次，细胞培养需要严格控制环境参数，如温度、CO2浓度和湿度等，这对实验设备的要求较高。
此外，不同细胞株的生长速度和特性也有所差异，对培养者的经验和技术水平提出了要求。
综上所述，动物细胞培养是一项重要的实验技术，具有广泛的应用前景和经济价值。
通过细胞培养，可以获得大量的细胞材料，用于细胞生物学研究和新药的研发。
然而，动物细胞培养也面临着挑战和困难，需要进行严格的细胞鉴定和纯度检测，以及合理控制环境参数。
竭诚为您提供优质文档/双击可除动物细胞传代培养实验报告篇一：细胞传代培养实验报告细胞传代培养一.实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的应用打下基础。
二、原理从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
三、材料和试剂1、细胞：293细胞株2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精灯等四、操作步骤1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。
2、加入1~2ml0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。
3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱7.收拾整理超净台附：消化液配制方法：称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1L，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
动物细胞培养总结一．实验准备1.实验器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包装离心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。
蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。
取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。
过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。
过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。
玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。
浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。
瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。
浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。
取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。
换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。
（2）消毒灭菌1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。
若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。
若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。
2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。
加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。
灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。
待自然降温至常压才能打开气阀。
玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。
2.无菌间消毒及设备检查用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。
配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。
用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。
检查CO2总压力表，若读数不足四分之一提前预定CO2瓶，换瓶时需要扳手。
CO2培养箱最下层的增湿盘须定期观察加水，将增湿盘内注入1/2无菌蒸馏水，并将盘直接放置在培养箱中央。
启动培养箱，培养箱接通电源，增湿盘加水，连接好气体供给，检查有无漏气，输入系统设置。
设置温度和二氧化碳。
紫外照射无菌间30分钟，注意屋内不要有人以及培养基等试剂。
3.细胞培养用液的配置及分装RPM1640培养基配制：将干粉型RPM1640培养基溶于总量1/3的去离子水中，再用1/3水冲洗包装内2次，倒入培养基中，以保证所有干粉都溶解成培养液，根据产品说明的要求和实验补加谷氨酰胺和NaHCO3 ,倾斜三角瓶轻轻放入转子，用磁力搅拌器搅拌2h。
用泵使培养基在超净台内通过灭菌的过滤器，过滤除菌，分装后置4度冰箱保存备用。
使用前调pH至7.0，加双抗于培养液中浓度为1%，使用时加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的处理：使用前应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体，将胎牛血清放入56度水浴中30分钟，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。
分装前提前2天放4度冰箱解冻，溶解完全后于超净台内分装为25ml每管，留2管放四度备用，余下放-20度冻存。
配制含血清培养基或冻存液前务必提前一天取出分装后的血清四度溶解备用，血清融化很慢。
5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸馏水， NaHCO3溶于水后，过滤除菌。
0.25%胰蛋白酶液200ml在超净台内分装成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度备用。
双抗溶液配制：80万单位青霉素加4ml灭菌D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。
100万单位链霉素加5ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。
两溶液各取0.5ml混合，加入9mlD-Hanks液，则成含青链霉素各1万单位/ml，分装后置于4度冰箱保存备用。
二．操作步骤注意事项：1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。
2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。
3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。
4、所有物品放入超净台需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗内时需要重新用酒精棉擦拭。
开始工作：1、实验前换紫外照过的白大褂和拖鞋。
2、戴橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。
3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。
4、胰酶消化缓慢时可以将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促进消化。
1.细胞复苏提前预冷离心机，设参数为4度，1000r/min,5min。
将枪头，装有离心管的饭盒，垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。
超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时取出无血清培养基和含血清培养基37度水浴加热。
关闭紫外，打开风机，升高窗高，点燃酒精灯，用镊子从饭盒中取2个15ml离心管放至试管架，每管加入3ml无血清培养基，提前剪好2条封离心管的封口膜备用。
戴上橡胶手套再套上线手套，用镊子从液氮中取出塑料冻存管，用手拿冻存管迅速浸入37度水浴中，剧烈急速摇晃冻存管，因为有防水胶布缠裹不用担心进水染菌，使其急速融化，注意管内冻存细胞的融化情况。
基本转为液态时将冻存管取出，摘下线手套，冻存管转移至超净台内，用酒精擦手，擦拭冻存管尤其管口，撕下胶布和封口膜，再擦拭管口，整个溶解过程尽量在30s至1min内完成。
(注意：这一步对细胞存活率至关重要。
既要尽快融化以减少融化过程对细胞的损害，又要尽可能减少细胞在较高温度停留的时间以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在烧杯内不管。
)打开冻存管管盖，逐滴加入1ml无血清培养基，轻柔地将冻存管内的细胞悬液吸取出来，转移至已备好的离心管内，轻轻摇混匀，盖上管盖，轻轻地上下颠倒混匀。
封上封口膜。
低俗离心1000r/min,5min。
小心地吸出上清液，要求上清液尽可能吸走，同时又不触及管底沉淀的细胞。
（较高要求时可以用手指轻弹离心管管底，将细胞团分散，加入10ml无血清培养基混匀离心10min 弃上清再洗一次，有助于减少DMSO残留。
）加3至5ml培养液至沉淀的细胞，轻轻摇晃使分散成细胞悬液，将细胞转移至培养瓶中，拧紧盖子，转移至培养箱中再反旋拧松半圈，以利于瓶口内外进行气体交换，注意取出培养瓶时须先拧紧瓶口。
37度恒温箱中培养。
第二天观察细胞生长情况。
培养基瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。
收好物品，擦一遍台子，灭酒精灯。
2传代培养附着型胞(adherentcell)传代培养离心法提前预冷离心机，设置好参数4度，1000r/min,5min。
倒液法不需要。
将灭菌枪头，装有离心管的饭盒，新培养皿/瓶,垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。
超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时从冰箱取出PBS,胰酶，含血清培养基于37度水浴加热。
关闭紫外，打开风机和照明，升高窗高，点燃酒精灯，将所需试剂先擦瓶底，放在台子上再擦侧壁一圈，擦瓶口瓶盖，撕下封口膜，再仔细擦一遍瓶口。
用喷过酒精的塑料筐将细胞培养瓶拧紧盖子拿到超净台旁的椅子上放平放稳，每三瓶/皿一摞拿入超净台先擦最下面一个的底部，擦好后放在台面上，擦一摞的侧面一圈，在分别擦底面顶面瓶口，直到所有培养瓶各个面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker标记字迹的部位，酒精会擦掉字迹，若擦到字迹待酒精干后立即补写上以防事后记不清。
轻轻倒掉旧培养液，注意不要使液体倒流回来冲击细胞，挂在外壁的残留液滴用酒精棉擦掉,培养瓶可以轻轻翻转瓶子使细胞生长的面在上，顶面在下，液体留至顶面后直接倒掉液体。
加1ml PBS，注意枪冲着不长细胞的培养皿侧壁或翻转培养瓶朝瓶的顶壁或侧壁打入PBS，尽量不碰到瓶口或培养皿，若怀疑碰壁，弃掉枪头。
轻轻摇晃培养皿或瓶，使PBS沾到所有细胞，洗涤细胞一遍，轻轻倒掉PBS。
加入0.25%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀释（0.25%为1X胰酶），37℃作用数分钟。
等待消化期间准备好新的培养皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培养基。
消化中的皿盖好盖子或瓶拧紧盖子，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状，有10%细胞漂动时，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鲜培养基终止胰酶作用。
(若细胞将要分离而呈现圆粒状且80%细胞漂动，则不移去胰酶，在胰酶作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰酶作用，吹打成细胞悬液转移至离心管，封上封口膜，离心后再吸掉上清液。
）轻轻摇晃培养瓶使细胞自瓶壁脱落，以吸管上下轻轻吸放数次以打散细胞团块，注意吹打时有系统性的将所有面积都打到不要集中只吹打一处而一些地方没吹打到，吸和吹时枪头都不要离开液面以减少气泡，气泡多破裂时对细胞有冲击且会增加体积不利于操作，培养瓶吹打时操作角度小不方便，用倒液法（10%细胞漂动即倒掉胰酶加含血清培养基终止消化）时吹打细胞要用二档多吹打几次，用皿或离心法（80%细胞飘动不弃胰酶直接加含血清培养基再离心弃上清）时细胞很容易脱落，可以用一档轻轻吹打，保证所有面积都吹打到即可。
混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，拧紧瓶盖，镜下观察细胞数量多，培养液澄清，若细胞密度过低将影响生长可适当补充细胞悬液，若细胞密度过大将影响迅速生长一天后即需传代，可根据实验适当添加培养基或细胞悬液使生长速度符合预期，转移至CO2培养箱，拧松半圈瓶盖，37度培养。
试剂瓶瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。
密封收好物品。
擦一遍台子，灭酒精灯。
3细胞换液取待用的细胞，旋紧瓶盖。
弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。
用微量枪加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。
用微量枪加入适量的细胞培养液于培养瓶中。
旋紧瓶盖。
将细胞置于5%CO2、37度培养箱，反旋拧松瓶盖半圈，培养。
4细胞冻存1>准备工作：提前一天将血清FBS从-20度取出放在4度冰箱解冻。
