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骨髓细胞微核试验(保健食品)1.实验动物小鼠是微核试验的常规动物，也可选用大鼠。
通常用7周~12周龄，体重25g~30g的小鼠或体重150 g~200 g的大鼠。
每组用两种性别的动物至少各5只。
动物购买后适应环境至少3天。
2．剂量及分组受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2LD50，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4LD50和1/8LD50作为中、低剂量。
急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出LD50时，高剂量组则按以下顺序：a) 10g/kg体重; b)人的可能摄入量的100倍;或c) 一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。
另设溶剂对照组和阳性对照组。
阳性对照物可用环磷酰胺40mg/kg体重经口或腹腔注射(首选经口)给予。
3．操作步骤3.1 受试物配制一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳化液或悬浊液。
受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液(或悬浊液、乳浊液等)保存具有稳定性。
3.2 实验动物的处理经口灌胃。
根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，确定取材时间。
常用30h给受试物法。
即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h，颈椎脱臼处死动物。
3.3 标本制备取胸骨或股骨,用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀,常规涂片,或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片,涂片自然干燥后甲醇固定5~10min。
当日固定后保存。
将固定好的涂片放入Gleams应用液中，染色10~15 min，立即用pH6.8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗、晾干。
写好标签，阴凉干燥处保存。
3.4 阅片选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域,在油镜下观察。
以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。
本法系观察嗜多染红细胞的微核。
用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。
兽药临床前毒理学评价试验指导原则一、概述（一）定义与目的为保障新兽药对使用对象动物（靶动物）的安全，特别是人的食品消费安全，必须对临床前兽药的毒理学（或安全性）进行评价。
目前，对兽药的安全性进行评价一般采取毒理学评价方法，包括三性（急性、亚慢性、慢性毒性）试验和三致（致突变、致畸、致癌）试验，以预测新兽药的安全性。
临床前药物毒理学评价的目的是预测临床用药的安全性，为临床试验提供可靠的参考。
毒理学评价结果不但为最后确定该化合物是否可以作为新兽药使用提供科学依据，还是制订动物性食品中最高残留限量（MRL）的重要依据。
（二）适用范围本指导原则适用于评价兽用化学药品（化学合成药、抗生素、药物饲料添加剂）及消毒剂临床前的安全性。
二、毒理学评价程序及内容兽药毒理学评价试验一般分为五个阶段，具体研究内容如下：（一）第一阶段：急性毒理学试验阶段的测定：所有用途的原料药必做；1.经口LD50的测定：注射用原料药必做，肌注、皮下注射或腹腔注射2.注射途径LD50途径任选一种；3.经皮LD的测定：供皮肤给药的原料药必做；504.皮肤刺激试验：供注射和透皮吸收的制剂必做；5.肌肉刺激试验：供肌内注射的制剂必做；6.眼结膜刺激试验：眼科用、喷雾和易挥发的制剂必做；7.粘膜刺激试验：子宫注入剂、喷雾和易挥发的制剂必做；8.溶血性试验：静脉注射用制剂必做。
（二）第二阶段：亚慢性毒性试验阶段研究内容有：30～90天亚慢性毒性试验：所有原料药必做；（三）第三阶段：致突变试验阶段原料药必做此阶段试验，各种制剂可不做此阶段试验。
1.Ames试验，必做；2.小鼠骨髓细胞微核试验，必做；3.小鼠精子畸形试验或睾丸精原细胞染色体畸变分析试验任选一项，必做；4.小鼠骨髓细胞染色体畸变分析试验，必要时选做；5.显性致死试验，必要时选做；以上致突变试验的组合必须考虑原核细胞和真核细胞、生殖细胞与体细胞、体内和体外试验相结合的原则，任何原料药不能低于三项，必要时做四至五项；如果在1～3项试验有阳性结果或可疑时，可选做第4、5项试验。
兽药临床前毒理学评价试验指导原则一、概述（一）定义与目的为保障新兽药对使用对象动物（靶动物）的安全，特别是人的食品消费安全，必须对临床前兽药的毒理学（或安全性）进行评价。
目前，对兽药的安全性进行评价一般采取毒理学评价方法，包括三性（急性、亚慢性、慢性毒性）试验和三致（致突变、致畸、致癌）试验，以预测新兽药的安全性。
临床前药物毒理学评价的目的是预测临床用药的安全性，为临床试验提供可靠的参考。
毒理学评价结果不但为最后确定该化合物是否可以作为新兽药使用提供科学依据，还是制订动物性食品中最高残留限量（MRL）的重要依据。
（二）适用范围本指导原则适用于评价兽用化学药品（化学合成药、抗生素、药物饲料添加剂）及消毒剂临床前的安全性。
二、毒理学评价程序及内容兽药毒理学评价试验一般分为五个阶段，具体研究内容如下：（一）第一阶段：急性毒理学试验阶段的测定：所有用途的原料药必做；1.经口LD50的测定：注射用原料药必做，肌注、皮下注射或腹腔注射2.注射途径LD50途径任选一种；3.经皮LD的测定：供皮肤给药的原料药必做；504.皮肤刺激试验：供注射和透皮吸收的制剂必做；5.肌肉刺激试验：供肌内注射的制剂必做；6.眼结膜刺激试验：眼科用、喷雾和易挥发的制剂必做；7.粘膜刺激试验：子宫注入剂、喷雾和易挥发的制剂必做；8.溶血性试验：静脉注射用制剂必做。
（二）第二阶段：亚慢性毒性试验阶段研究内容有：30～90天亚慢性毒性试验：所有原料药必做；（三）第三阶段：致突变试验阶段原料药必做此阶段试验，各种制剂可不做此阶段试验。
1.Ames试验，必做；2.小鼠骨髓细胞微核试验，必做；3.小鼠精子畸形试验或睾丸精原细胞染色体畸变分析试验任选一项，必做；4.小鼠骨髓细胞染色体畸变分析试验，必要时选做；5.显性致死试验，必要时选做；以上致突变试验的组合必须考虑原核细胞和真核细胞、生殖细胞与体细胞、体内和体外试验相结合的原则，任何原料药不能低于三项，必要时做四至五项；如果在1～3项试验有阳性结果或可疑时，可选做第4、5项试验。
小鼠骨髓多染红细胞微核实验目的和意义微核试验用于检测受试物在哺乳动物所引起的染色体或原红细胞有丝分裂器损伤，以确定该受试物有无诱变性。
通过本次实验学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞微核测定方法。
原理正常细胞的有丝分裂的分裂中期，染色体均匀地排列在赤道板附近，到分裂后期便分成两份，分别向两极移动，并在末期分别形成两个子细胞的核。
如果由于某种化学物质的作用而使分裂期的细胞染色体受到损伤，在中期就会观察到染色体断裂，在进入分裂后期时，这种断片落后于向两极移动的染色体而滞留在赤道板附近，当其它染色体分别形成子细胞核时，这些落后的断片便独立形成微核，如果纺锤体功能受损，也可产生微核。
由上可见，微核的出现和染色体畸变有密切相关性，同时微核的观察是在细胞的间期，不必分析中期相，这比分析染色体畸变要方便一些。
进行骨髓细胞微核分析一般观察红细胞，记数嗜多染红细脑中微核出现率。
器材与试剂1、器材载玻片、推片、血细胞计数器、滴管、注射器、解剖剪、镊子、止血钳、晾片架、滤纸、电吹风机、染色缸、研钵、恒温水浴箱、光学生物显微镜（或荧光显微镜）。
2、试剂小牛血清；甲醇；吉姆萨储备液：将1g 吉姆萨倒入研钵内，加入少许甘油混合研细，分次倒入剩余的甘油至66ml，转移到烧杯内（或试剂瓶内）。
放入55~60℃水浴中并不断搅动至2h。
取出冷却后加入60ml甲醇，混匀后置室温，2~3周后过滤，保存于棕色瓶内备用（存放时间越长染色效果越好）。
吉姆萨染色液：实验前取吉姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀。
磷酸盐缓冲液（pH 6.8）阳性对照物：环磷酰胺。
操作步骤一、试验动物及处理1、动物的选择：选用小鼠，每组10只动物，雌雄各半。
小鼠体重在18~20g，7~12w。
2、染毒途径：采用腹腔注射给药。
3、剂量选择：环磷酰胺按50mg/kg剂量染毒，同时设立阴性对照（空白对照）。
4、染毒次数和取样时间：采用30h给药法，即两次给药间隔24h，在第二次给药后6h处死动物采集骨髓。
