实验五 小鼠骨髓细胞微核试验

骨髓细胞微核试验(保健食品)1.实验动物小鼠是微核试验的常规动物，也可选用大鼠。

通常用7周~12周龄，体重25g~30g的小鼠或体重150 g~200 g的大鼠。

每组用两种性别的动物至少各5只。

动物购买后适应环境至少3天。

2．剂量及分组受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2LD50，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4LD50和1/8LD50作为中、低剂量。

急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出LD50时，高剂量组则按以下顺序：a) 10g/kg体重; b)人的可能摄入量的100倍;或c) 一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。

另设溶剂对照组和阳性对照组。

阳性对照物可用环磷酰胺40mg/kg体重经口或腹腔注射(首选经口)给予。

3．操作步骤3.1 受试物配制一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳化液或悬浊液。

受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液(或悬浊液、乳浊液等)保存具有稳定性。

3.2 实验动物的处理经口灌胃。

根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，确定取材时间。

常用30h给受试物法。

即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h，颈椎脱臼处死动物。

3.3 标本制备取胸骨或股骨,用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀,常规涂片,或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片,涂片自然干燥后甲醇固定5~10min。

当日固定后保存。

将固定好的涂片放入Gleams应用液中，染色10~15 min，立即用pH6.8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗、晾干。

写好标签，阴凉干燥处保存。

3.4 阅片选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域,在油镜下观察。

以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。

本法系观察嗜多染红细胞的微核。

用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。

小鼠骨髓多染红细胞微核实验目的和意义微核试验用于检测受试物在哺乳动物所引起的染色体或原红细胞有丝分裂器损伤，以确定该受试物有无诱变性。

通过本次实验学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞微核测定方法。

原理正常细胞的有丝分裂的分裂中期，染色体均匀地排列在赤道板附近，到分裂后期便分成两份，分别向两极移动，并在末期分别形成两个子细胞的核。

如果由于某种化学物质的作用而使分裂期的细胞染色体受到损伤，在中期就会观察到染色体断裂，在进入分裂后期时，这种断片落后于向两极移动的染色体而滞留在赤道板附近，当其它染色体分别形成子细胞核时，这些落后的断片便独立形成微核，如果纺锤体功能受损，也可产生微核。

由上可见，微核的出现和染色体畸变有密切相关性，同时微核的观察是在细胞的间期，不必分析中期相，这比分析染色体畸变要方便一些。

进行骨髓细胞微核分析一般观察红细胞，记数嗜多染红细脑中微核出现率。

器材与试剂1、器材载玻片、推片、血细胞计数器、滴管、注射器、解剖剪、镊子、止血钳、晾片架、滤纸、电吹风机、染色缸、研钵、恒温水浴箱、光学生物显微镜（或荧光显微镜）。

2、试剂小牛血清；甲醇；吉姆萨储备液：将1g 吉姆萨倒入研钵内，加入少许甘油混合研细，分次倒入剩余的甘油至66ml，转移到烧杯内（或试剂瓶内）。

放入55~60℃水浴中并不断搅动至2h。

取出冷却后加入60ml甲醇，混匀后置室温，2~3周后过滤，保存于棕色瓶内备用（存放时间越长染色效果越好）。

吉姆萨染色液：实验前取吉姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀。

磷酸盐缓冲液（pH 6.8）阳性对照物：环磷酰胺。

操作步骤一、试验动物及处理1、动物的选择：选用小鼠，每组10只动物，雌雄各半。

小鼠体重在18~20g，7~12w。

2、染毒途径：采用腹腔注射给药。

3、剂量选择：环磷酰胺按50mg/kg剂量染毒，同时设立阴性对照（空白对照）。

4、染毒次数和取样时间：采用30h给药法，即两次给药间隔24h，在第二次给药后6h处死动物采集骨髓。

小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验是一种用于检测物质对小鼠骨髓细胞基因毒性的方法。

骨髓细
胞微核是正常细胞中小核细胞数量的标志。

在受到某些化学物质的影响后，骨髓细胞可以
形成异常小鼠骨髓微核和形态不规则的细胞，这是指指出该物质可能是致癌物或基因毒物，因此，这种试验可以用于评估某种物质对人类健康的风险。

在小鼠骨髓微核试验中，通常将小鼠的骨髓细胞放置在培养基中进行培养，然后将待
检物质加入培养中。

待检物质可能是化学物质、辐射或生物质等。

随后，经过一定时间后，分离的细胞会被染色并进行显微镜检查，以确定细胞数量和微核的数量。

通过小鼠骨髓细胞微核试验得出的结果可以帮助研究人员判断待检物质是否是基因毒
物和可能是致癌物，是否影响细胞的正常生长和健康。

因此，小鼠骨髓细胞微核试验已成
为一种广泛使用的实验室技术，以评估物质的潜在致癌性和毒性。

总之，小鼠骨髓细胞微核试验是一种快速且有效的实验室技术，用于评估化学物质、
辐射等物质对人类健康的影响和风险。

虽然该方法需要一定的经验和技能，但它已被广泛
使用于实验室中，并成为确定制定公众卫生政策的重要工具之一。

骨髓细胞微核试验(保健食品)1.实验动物小鼠是微核试验的常规动物，也可选用大鼠。

通常用7周~12周龄，体重25g~30g的小鼠或体重150 g~200 g的大鼠。

每组用两种性别的动物至少各5只。

动物购买后适应环境至少3天。

2．剂量及分组受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2LD50，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4LD50和1/8LD50作为中、低剂量。

急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出LD50时，高剂量组则按以下顺序：a) 10g/kg体重; b)人的可能摄入量的100倍;或c) 一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。

另设溶剂对照组和阳性对照组。

阳性对照物可用环磷酰胺40mg/kg体重经口或腹腔注射(首选经口)给予。

3．操作步骤3.1 受试物配制一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳化液或悬浊液。

受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液(或悬浊液、乳浊液等)保存具有稳定性。

3.2 实验动物的处理经口灌胃。

根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，确定取材时间。

常用30h给受试物法。

即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h，颈椎脱臼处死动物。

3.3 标本制备取胸骨或股骨,用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀,常规涂片,或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片,涂片自然干燥后甲醇固定5~10min。

当日固定后保存。

将固定好的涂片放入Gleams应用液中，染色10~15 min，立即用pH6.8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗、晾干。

写好标签，阴凉干燥处保存。

3.4 阅片选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域,在油镜下观察。

以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。

本法系观察嗜多染红细胞的微核。

用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。

院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠实验四：小鼠骨髓细胞微核试验1、实验目的通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE）的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试动物是否具有致突变作用。

主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。

2、实验原理微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。

红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，但微核仍保留于PCE细胞中，因此可通过计数PCE细胞中的微核来判断受试物的致突变作用。

3、实验材料3.1实验动物7～12周龄健康小鼠，体重20~30g，10只，雌雄各半。

3.2试剂小牛血清（灭活）；甲醇；姬姆萨染色液：磷酸盐缓冲液（pH6.8）：丝裂霉素C。

3.3器材生物显微镜、恒温水浴箱、解剖剪、镊子、止血钳、注射器、灌胃针头、载玻片、玻璃染色缸、塑料吸瓶、吸管、乳钵、干净纱布、滤纸等。

4、操作步骤4.1试剂的配制4.1.1小牛血清（灭活）小牛血清滤菌后置于56℃恒温水浴保温30 min进行灭活。

4.1.2磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠(Na2HPO4) 9.47 g溶于1000ml蒸馏水中;1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾(KH2PO4) 9.07g溶于1000ml蒸馏水中;1/15mol/L磷酸氢二钠溶液50ml与1/15mol/L磷酸二氢钾溶液50ml混合即可。

4.1.3姬姆萨染色液将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后，再加入125ml甘油，混合均匀。

置37℃恒温箱中保温48h。

保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。

取出过滤，即为姬姆萨储备液，两周后可使用。

实验前取姬姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀，即可。

4.2实验动物的处理步骤如下:（1）给药根据急性LD50，选用使动物出现中毒，但不引起动物死亡的剂量，受试小鼠腹腔注射丝裂霉素C1.5～2mg/kg（2）骨髓细胞液的制备在给与受试物6h后，小鼠脱颈椎处死，打开胸腔，沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断，剥掉附着其上的肌肉，用滤纸擦干血污（3）PCE及微核的观察涂片在洁净的玻片一端滴小牛血清1滴，横向剪开胸骨，暴露骨髓腔，然后用止血钳挤出骨髓液至血清中，混匀，推片（长度约2～3cm），在空气中晾干（一般以两节胸骨髓液涂一张片子为宜）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定5～10min，取出晾干染色固定好的涂片放入姬姆萨应用液中染色15～30min，蒸馏水冲洗，干燥镜检先在低倍镜下观察，选择分布均匀，染色较好的视野，然后换到油镜下观察计数。