04 冷冻干燥保护剂

细菌冻干保护剂配方
细菌冻干是一种常见的保存细菌的方法，但在冻干过程中，细菌容易受到氧化、脱水等因素的影响，从而导致细菌数量减少或丧失活性。

为了提高细菌冻干的保护效果，可以添加一些保护剂来保护细菌。

下面是一种常用的细菌冻干保护剂配方：
成分：
1. 磷酸二氢钾 0.1mol/L
2. 葡萄糖 5% (w/v)
3. 甘油 10% (v/v)
4. 酪蛋白酸钠 0.5% (w/v)
5. 硫酸镁 0.01mol/L
6. NaCl 0.9% (w/v)
制作方法：
1. 在一烧杯中加入适量的去离子水，加热至85℃左右。

2. 待水温降至60℃左右时，加入磷酸二氢钾和葡萄糖，充分溶解。

3. 加入甘油和酪蛋白酸钠，充分混合。

4. 最后加入硫酸镁和NaCl，搅拌均匀。

5. 调节pH值至7.0左右，再过滤灭菌即可。

使用方法：
将细菌培养至对数生长期，加入预先配制好的保护剂，混匀后放入冻干机中进行冻干处理。

细菌冻干保护剂配方中的甘油和葡萄糖可以提供必要的营养物质和保护剂，酪蛋白酸钠可以保持细菌的活性，硫酸镁和NaCl则可以调节渗透压和维持细胞的完整性，从而提高细菌的存活率和保护效果。

冷冻干燥过程中保护剂对脂质体粒径影响的
实验研究
冷冻干燥是一种常用的制备脂质体的方法，但该过程中脂质体容易发生聚集和脱水等问题。

为了解决这些问题，可以向冻干液中添加保护剂。

在实验中，可以选择不同的保护剂，并对脂质体的粒径进行测定。

常用的保护剂包括蔗糖、甘露醇和羟丙基-β-环糊精等。

实验步骤如下：
1. 制备脂质体悬浮液：根据所需的脂质体组成，将所需的磷脂和胆固醇等溶解在有机溶剂中，并用旋转蒸发仪将有机溶剂蒸发干净，制得脂质体固体膜。

随后，向固体膜中加入含磷酸盐缓冲液，使其形成悬浮液。

2. 冷冻：将脂质体悬浮液分装到合适的容器中，然后将容器放入液氮中进行冷冻。

冷冻速度要尽可能快，以避免脂质体的聚集。

3. 冻干：将冷冻后的样品置于真空条件下，使用冻干机进行冻干。

通过升温并施加负压，将样品中的水分从冰晶直接转化为气态，使样品变得干燥。

4. 粒径测定：使用粒径分析仪，如动态光散射仪（DLS）或激光衍射仪等，测定冷冻干燥后脂
质体的粒径。

可以比较不同保护剂条件下的粒径差异。

通过以上实验，可以得到不同保护剂对脂质体粒径的影响。

保护剂可提供一定的保护作用，减少脂质体的聚集和脱水现象，从而得到较为均匀的粒径分布。

不同保护剂的选择可以根据所需的应用和研究目的进行优化。

膜通 透性 的改 变 和 代谢 损 伤 ［ 因此 ， 择适 宜 的 。 选 冷冻 温度 ， 加入 合适 的保 护 剂 减少 细 胞 膜 在 冷冻 干 燥 中的损 伤 ， 提高 菌存 活率 的关键 。 是 研究 了在冷 冻 干 燥前 合 适 的预 冻 温 度 ， 然后 以 甘油 、 蔗糖 、 脱脂 牛奶 、 海藻糖 为保 护剂 ， 采用 正 交试 验设 计 ， 化组 合 ， 优 筛选 出冷冻干 燥保 藏 中度 嗜热菌
２ ０ 高 压 灭 菌 ２ ｍｉ。 Ｂ： 质 硫 粉 高 压 灭 菌 。， ０ ｎ 单
２ ｍｉ 。将 Ｂ硫粉 以 １ ５ ０ ｎ 。 ％的量加 入到 Ａ 培养基 中 ， 作 为 中度 嗜热 菌 的培养基 。
１ １ ３ 保 护剂 系统 。预冻 试 验 保 护 剂 ： 油 ５ ， 。。 甘 ％
１ ％，２ ０ １ ％。正交试 验保 护剂 组合 ： 甘油 （ ％ ，２ ， ６ １％ １ ％） 蔗糖 （ ％ ，２ １ ％） 脱 脂 奶 粉 （ ％， ％ ， ８ ， ６ １ ％， ８ ， ４ ６
８ ％） 海 藻糖 （ ％ ， ％ ，０ 。 ， ２ ６ １ ％）
１ ２ 试 验 过 程 ．
周洪波 ， 曾伟 民 ， 李 莹 ， 刘 晰 ， 冠周 邱
（ 中南 大学 资 源加 工与 生物 工程 学院 ， 长沙 ４ ０ ８ ） １ ０ ３
摘 要 ： 通过正交试验结果 直观分析 、 因素指标分析和方差分析 ， 研究 真空冷冻干燥保藏法 中保护剂 的作用 。结果 表明 ， 保
护剂 的最 佳 组 合 类 型 为 甘 油 １ ％ 、 ２ 蔗糖 ６ 、 脂 牛 奶 ４ 、 藻 糖 １ ％ 。 保 护剂 种 类 对 提 高 存 活 率 的 影 响 依 次 为 ： 油 ＞海 藻 糖 ％ 脱 ％ 海 ０ 甘 ＞脱 脂 牛奶 ＞蔗 糖 。 使 用 最 佳 保护 剂组 合 可 使 冷 冻 干 燥 中度 嗜 热 菌 的 存 活 率 达 到 ８ ． ％ 。 ３７

一些常用的冷冻干燥保护剂
分类
保护剂
复合物 糖类 盐类 醇类 酸类 聚合物
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 等
助于抗原性物质在胞内被加工，被 MHC 分子特异性的结合、保护、运输并递 呈给效应细胞。
②抗原寻的（ antigen targeting ）
指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括 吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原 与细胞受体的结合等有重要作用。
③免疫调节（immune modulation ） 是指任何可以修饰的免疫效应细
２、保护剂浓度：严格按照配方执行。 ３、保护剂配制方法：糖类不能用121℃高压灭菌处理。 ４、保护剂酸碱度（PH 值）：主要对M的影响。
三、常用的冻干保护剂（稳定剂） 明确不同种类微生物需要添加不同保护剂
（一）细菌的保护剂 ① 需氧或兼氧厌氧菌：５％蔗糖脱脂乳或５％蔗糖、 1.5％明胶； ② 厌氧性细菌：含1.5％谷氨酸钠的１％乳糖或10％脱 脂乳或7.5％葡糖血清。 注：脱脂乳：20％脱脂奶粉溶于水配制而成。
疫苗冻干保护剂组成
1. 营养液： ? 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分； ? 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状， 增加溶解度 2. 赋形剂： ? 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 ? 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： ? 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存 期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。

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• 脱水效应
（1）水溶液中蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附 着一单层水，这就是所说的水合层(hydration shell)。一般来讲， 参与完全水合作用的水含量为0.3-0.35g（水）/g（蛋白质）。 而在冻干蛋白质产品中水的含量一般不超过10%，因此，必定 有一部分结合水在干燥过程中被除去。 （2）结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白 质变性。这是因为富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在乏 水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中电荷 平衡，电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用， 从而使蛋白质发生聚集 。
• 低温效应
生物制品中活性组分在降温与复温过程的一定温度范围内会发 生变性。如对卵清蛋白(ovalbumin)的研究发现，在-10℃~-40℃ 之间，其活性显著降低，而继续降温到在-192℃，活性几乎没 有变化。
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• 在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素 （例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变 温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等）都会 影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。 • 大量的实验研究表明，除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品，都需要添 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进 行有效的冷冻干燥和贮藏。

冻干保护剂及其保护机理的研究进展生命科学学院动物科学专业2008084533（学号）严忠平（姓名）指导教师郑新添【摘要】进入上个世纪的八九十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。

但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题。

冷冻干燥是目前保持微生物、动物组织、细胞及蛋白质等活性物质生物活性的一个有效的、普遍的方法．制品经完全冻结，并在一定的真空条件下使冰晶升华，从而达到低温脱水的目的，此过程即称为冷冻干燥，简称冻干，是冷冻和干燥的结合，其中冷冻与干燥引起的蛋白质变性的机理各不相同．【关键词】冻干保护剂保护机理药品生物自进入上个世纪的八九十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。

但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题。

冷冻干燥是目前保持微生物、动物组织、细胞及蛋白质等活性物质生物活性的一个有效的、普遍的方法．制品经完全冻结，并在一定的真空条件下使冰晶升华，从而达到低温脱水的目的，此过程即称为冷冻干燥，简称冻干，是冷冻和干燥的结合，其中冷冻与干燥引起的蛋白质变性的机理各不相同．冷冻干燥技术最早于1813年由英国人华莱斯顿(Wollaston)发明．自Heckly和Hammer(1911年)首次对微生物进行干燥保存以来，经过多年来的完善与发展，国内外学者们发现冷冻干燥技术具有与其他干燥方法无可比拟的优点E23，菌种在低温下干燥，各种成分、酶的活性丧失少；可以保持菌种的形态、色泽；复水性好，能很快地吸水还原成干燥前的鲜活状态；脱水彻底，保存期长，储存运输、销售方便．但是，在真空冷冻干燥过程中，冷冻和干燥不可避免地会造成部分微生物细胞的损伤、死亡，及某些蛋白分子的钝化．为了提高冷冻干燥微生物、蛋白质等生物制品的存活率与生物活性，人们进行了大量的研究，其中包括冷干过程中蛋白质的空间结构的变化，以及各种保护剂对这些变化的影响[1]．1 冷冻干燥保护剂冻干是复杂的相变过程,冻干制品在整个过程存在的各种应力,包括低温应力、冻结应力、干燥应力等,常常是直接或间接导致制品中蛋白质变性的因素 ,所以在冻干过程中需使用保护剂。

冻干保护剂对胶体微粒给药系统包封率和粒径的影响张海龙 097211043摘要：衡量脂质体和SLN药物品质的两个重要指标是脂质体和SLN包裹药物的粒径分布和包封率，在冷冻干燥过程中脂质体药物的粒径分布和包封率会发生变化。

本文综述了冻干保护剂的保护机理，在脂质体和SLN冷冻干燥过程中经常使用的四种冻干保护剂——葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖，以及这四种不同保护剂、不同浓度在冻干过程中对脂质体和SLN粒径和包封率的影响。

关键词：冻干保护剂，脂质体，固体脂质纳米粒1前言胶体微粒系统是靶向给药系统常用的载体，可注射给药，也可制成各种剂型，用于皮肤、鼻腔等粘膜，在生物技术药物的给药中亦起重要作用。

脂质体、固体脂质纳米粒（SLN）是胶体微粒系统常用的药物载体。

虽然脂质体和SLN可以利用其独有的特性将毒副作用大、在血液中稳定性差、降解快的药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的脂质体和SLN微粒中，这种微粒与人体细胞膜有相似成分而有良好生物相容性等特点，但它也存在一些缺点，影响着它在临床方面的应用[1]。

脂质体和SLN都是混悬液，易受pH值、温度、环境中物质以及包封的药物性质影响[2]。

在贮存期间易发生聚集、沉降、融合及药物渗漏，且主要脂质材料易氧化、水解，难以满足药物制剂稳定性的要求，使应用受到了很大限制[3]。

因此，通常采用冷冻干燥法提高脂质体和SLN的贮存稳定性。

制成冻干脂质体和冻干SLN可显著降低脂质和药物的水解和氧化速度。

同时，冻干保护剂也保持了脂质体膜结构的完整性，克服脂质体和SLN聚集、融合及药物渗漏等不稳定因素，显著提高贮存稳定性。

虽然冷冻干燥法对于脂质体和SLN的贮存、包装、运输等方面的方便和稳定都不失为一种良好的选择。

但在冷冻过程形成的冰晶会使脂质微粒聚集融合，在冷冻和解冻过程中，膜内外冰晶形成速度不同引起渗透压差，造成微粒裂解，所以在冷冻干燥过程中，应加入冷冻保护剂以减少破坏[4]。

不同种类与浓度的冻干保护剂对脂质体和SLN的保护能力各不相同，本文将讨论葡萄糖、蔗糖、甘露醇和海藻糖等作为冻干保护剂，对胶体微粒给药系统的冻干过程进行研究。

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5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理 1. 冷冻和干燥过程
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制 品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。
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第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂
冻干过程和储藏过程的变性机理 冷冻干燥保护添加剂的分类 糖/多元醇类保护剂 聚合物类保护剂 表面活性剂类、氨基酸类的保护剂
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• 如前所述，生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过 程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功 完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证 冻干生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品 在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们 研究和探索了大量有效的保护添加剂。
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• 冻结效应（包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化 以及相分离等 ）
（1）在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速 升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80%。当 溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进了化学反应。

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5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理 1. 冷冻和干燥过程
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制 品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。
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• 在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素 （例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变 温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等）都会 影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。 • 大量的实验研究表明，除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物 除了一些食品、人血浆、 除了一些食品 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品，都需要添 料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品， 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂， 加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进 行有效的冷冻干燥和贮藏。
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2. 储藏过程
• 蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变 蛋白质凝聚： 性的主要因素之一。导致蛋白质凝集可能是物理（非共价） 相互作用，也可能是蛋白质发生化学凝集（共价）。 • 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天冬酰 脱酰胺作用： 胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中易于发生脱酰胺作 用的两种氨基酸。 • 非酶褐变：也称作Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖） 非酶褐变： 与蛋白质中的赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水 络合物。 • 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，组氨酸His，色 氧化反应： 氨酸Trp和酪氨酸Tyr残基的侧链是发生氧化反应的可能位置。 • 水解作用 虽然冻干的蛋白质中含有极少量的水分，但在贮藏 水解作用: 过程中仍然会发生水解作用。

剂，在此 基础 上将其添加到微胶囊 中，观察对 Ｌ ． ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ａ ｒ ｕ ｍ Ｌ Ｉ Ｐ 一 １ 微胶囊 形态 、释 放性 等性 能的影响。试验 结果表 明冷冻 干燥保护 剂的最佳 配方为质量分数分别为甘油 ２ ％、 麦芽糖 １ ％、 Ｌ ． 半胱氨 酸 ２ ％、 乳糖 ２ ％， 此时微胶囊的包埋率为 ６ ７ ． ６ ０ ％， 冻干存活 率为 ８ ３ ． ８ ０ ％；与未添 加保 护剂的空 白对照组相 比，添加适宜保护剂 的微胶囊在表观形态、肠液释放 性、耐 胃酸 性及 在不 同温度 （ ４ 、２ ０ 、３ ７ ￣ Ｃ）下 的耐贮 藏性能均显著提高 （ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） 。添 加适 宜保护剂 的微胶囊表面更加光滑致密 ， 粒径 更小，约 １ ０ ０ ｙ ｍ（ 空 白对照组约为 １ ５ ０ ￣２ ０ ０ ｍ） ；在模拟肠液 中，添 加适 宜保护剂 的微 胶囊 完全 释放仅需 ６ ０ ｍｉ ｎ ， 而空 白对照组需要 ９ ０ ａｉ ｒ ｎ才能释放完全 ； 在 耐胃酸性上，添 加适 宜保 护剂 的 Ｌ Ｉ Ｐ 一 １ 微胶囊在 １ ２ ０ ａｉ ｒ ｎ后 ，活菌数才 开始显 著下降 （ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） ，１ ５ ０ ｍｉ ｎ后 ，活菌数 下降约 ３ ０ ％；空白对照 组在 ９ ０ ｍｉ ｎ后活菌数 开始显著下 降 （ 尸 ＜ ｌ ０ ． ０ ５ ） ，１ ５ ０ ｍｉ ｎ后 ， 活菌数下降约 ４ ４ ％；在 ４ 、２ ０ 、３ ７ ℃贮藏 ２ ８ ｄ后，加保护剂组的活菌数分别下降 Ｏ ． ７ ６ 、１ ． ３ ３ 、１ ． ８ ８ ｌ ｇ （ ｃ ｆ ｕ ／ ｇ ） ，而空 白对 照 组的活菌数分别下 降 ０ ． ９ ６ 、 １ ． ５ ０ 、２ ． ４ ０ ｌ ｇ （ ｃ ｆ ｕ ／ ｇ ） 。试验结果表 明添加适 宜的冷冻干燥保护剂可 以提 高 Ｌ ． ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ａ ｒ ｕ ｍ Ｌ Ｉ Ｐ ． １ 微 胶 囊 的 性 能 ，为 工 业 化 生 产 中提 高 益 生 菌 微 胶 囊 的性 能提 供 一 定 的 理 论 和 技 术 指 导 。 关键词 ：包埋 ；干燥 ；优化 ；微胶 囊；植物乳杆 菌 Ｌ Ｉ Ｐ ． １

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2. 储藏过程
• 蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变 性的主要因素之一。导致蛋白质凝集可能是物理（非共价） 相互作用，也可能是蛋白质发生化学凝集（共价）。 • 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天冬酰 胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中易于发生脱酰胺作 用的两种氨基酸。 • 非酶褐变：也称作Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖） 与蛋白质中的赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水 络合物。 • 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，组氨酸His，色 氨酸Trp和酪氨酸Tyr残基的侧链是发生氧化反应的可能位臵。 • 水解作用: 虽然冻干的蛋白质中含有极少量的水分，但在贮藏 过程中仍然会发生水解作用。
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• 如前所述，生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过 程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功 完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证 冻干生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品 在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们 研究和探索了大量有效的保护添加剂。
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5.3 糖/多元醇类保护剂 1. 糖和多元醇的定义

保护剂一般为葡萄糖、甘露醇。

是为了保证冻干过程的顺利进行和调节渗透压的，增溶剂一般是根据你的具体药物去选择，这些都是在冻干前溶液中添加的，一般加泊洛沙姆之类的，以前做过一冻干粉加的是葡甲胺冻干保护剂有很多，包括蔗糖，乳糖，甘露醇等，一般的用量都在5%，我做过比较，貌似还是甘露醇的保护效果好，当然你也可以几个冻干保护剂连用。

引言由于冻干药品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性，因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等药品。

从国家药品监督管理局数据库得知，目前国内已有注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、注射用重组人干扰素α2b、冻干鼠表皮生长因子、外用冻干重组人表皮生长因子、注射用重组链激酶、注射用重组人白介素-2、注射用重组人生长激素、注射用A群链球菌、注射用重组人干扰素α2b、冻干人凝血因子VⅢ、冻干人纤维蛋白原、间苯三酚口服冻干片等冻干药品获准上市。

截止2000年2月，美国FDA已批准的生物技术药共计76个。

冷冻干燥技术最早于1813年由英国人Wollaston发明。

1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素、菌种、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干保存，取得了较好效果。

在第二次世界大战中，对血液制品的大量需求大大刺激了冷冻干燥技术的发展，从此该技术进入了工业应用阶段。

此后，制冷和真空设备的飞速发展为快速发展冷冻干燥技术提供了强有力的物质条件。

进入上个世纪的***十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。

但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题。

2 药品冷冻干燥原理及特点药品冷冻干燥是指把药品溶液在低温下冻结，然后在真空条件下升华干燥，除去冰晶，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水的干燥方法。

1欣谕冻干前言欣谕冷冻干燥广泛用于制备治疗性蛋白质制剂，蛋白冻干制剂可以提供更好的保质期，方便药物的储藏和运输，然而，蛋白在冻干过程中存在许多应力，包括低温应力、冻结应力(枝状冰晶的形成、离子强度的增加、pH值的改变、相分离等)、干燥应力(失去蛋白质表面水分子)等，这些应力常常直接或间接导致蛋白质类药物失去天然构象从而变性或失活。

所以即使采用了冷冻干燥这种温和的干燥方式，还需要加入合适的冻干保护剂以很好的保护蛋白稳定性。

冷冻干燥保护剂对于蛋白质的保护原理已经被研究讨论了几十年，形成了一些被普遍接受的共识。

如在冻结阶段，最主要的假说为“优先化作用”;在干燥阶段最主要的有2种假说，即“玻璃化”和“水置换”。

冷冻干燥保护剂的分类方式很多，有文献中提出了一个公式化模型，按照功能把冷冻干燥保护剂分类，包括5类: ①pH缓冲剂，如Tris、组氨酸、枸橼酸等;②配体，可以优化蛋白质的热力学稳定性;③稳定剂，一般是双糖，如蔗糖、海藻糖等，可通过抑制蛋白质的展开和提供玻璃基质起保护作用;④非离子表面活性剂，可减少蛋白质的聚集;⑤填充剂，如甘露醇、甘氨酸、羟乙基淀粉、血清白蛋白等，可提高产品的物理成型性。

这里我们简要介绍其中几种。

2缓冲盐首先，蛋白质稳定性受环境pH的影响，缓冲液选择在蛋白质制剂的开发过程中是最关键的，并且必须在配制阶段建立。

在选择缓冲液pH时，建议pH不要太接近蛋白质的pI(等电点)以避免聚集。

磷酸盐是蛋白质配方中最常见的缓冲剂之一，特别是含水蛋白质药物，有效pH 值范围为5.8-8.0，并且具有生物相容性。

然而，正如“冷冻过程中的pH变化”所讨论的那样，磷酸盐缓冲液，特别是磷酸氢二钠，在冷冻过程中会发生显着的pH变化，因此不推荐用于pH敏感蛋白质。

相反，磷酸钾，组氨酸，三羟甲基氨基甲烷(Tris)和柠檬酸盐缓冲液在冷冻期间显示出最小的pH变化。

此外，低缓冲液浓度可有助于降低pH变化。

组氨酸是一种氨基酸，有效pH范围为5.5-7.4，它与生物pH相容，并且经常用于冷冻干燥的蛋白质。

冷冻干燥中冻干制剂的一些问题综述综述2013.6 陈亚飞摘要：冷冻干燥技术是生物制剂的主要生产工艺，采用冷冻干燥工艺可保持产品原有的理化性质和生物活性，且有效成分损失极少。

干燥后的产品形状、体积、晶型等理化指标均一性好。

产品因含水量低而易于长期保存, 因疏松多孔而使得加水后可迅速完全溶解。

但在冻干制剂的生产或实验中我们总会有一些冻干上的问题，下文就是我们在冻干制剂上的主要问题的分析。

关键词：制剂预冻共晶温度玻璃态转化崩解温度干燥稳定性水分保护剂一冷冻干燥技术1 冷冻干燥技术的发展随着真空泵和制冷机的出现，冷冻和干燥理念的结合，近些年来冷冻干燥技术在全世界发展迅速，应用非常广泛。

冷冻干燥技术的发展史已经百年有余，从最初发现冷冻干燥技术，以及真空条件下水的饱和蒸汽压于水的温度关系，到采用主动加热方法减短干燥时间并用于生产化。

1958年的第一届冷冻干燥会议促进了冻干的发展，在食品、药品、建材等行业得到广泛应用。

近些年来，伴随着电子计算机和传感测量技术在冻干领域的应用，冻干技术已加入高新技术领域行列。

人体器官的保存和再植的研究，营养保健食品的追求，超轻隔热陶瓷在航天飞机的应用，以及低温超导材料等纳米级超细微粉材料的制备，都需要真空冷冻干燥技术和设备。

在医药领域中，真空冷冻干燥技术对药品和医疗事业都有重要应用。

药品方面上包括生物制品（活菌菌苗、活毒疫苗、一些生物制品和生化药品等）、化药生产（多位注射剂：抗生素药、循环器官用药、中枢神经用药、维生素类和肿瘤用药等）、中药生产（中草药、中成药）；医疗事业上对保存血液、动脉、骨骼、皮肤、角膜和神经组织等各种器官上效果良好。

2 冷冻干燥的定义及优缺点简述冷冻干燥是指将被干燥含水物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用水的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥目的的一种干燥方法。

是将热能通过与物料接触的壁面以传导方式传给物料，使物料中的湿分气化并由周围空气气流带走而干燥的操作。

冻干保护剂的筛选
一、材料、仪器：
2ml装的蛋白原液、1000iu/ml青链霉素、伊利高蛋白脱脂高钙奶粉、蔗糖、高压蒸汽灭菌锅、真空冷冻干燥机
脱脂奶粉配料表：
配料：脱脂牛奶、食品添加剂：大豆磷脂
维生素：维生素A醋酸酯、胆钙化醇、维生素E醋酸酯、抗坏血酸。

二、方法：
表1 冻干剂配方
1、在超净工作台中用三角烧瓶中按表1配方配好保护剂，混匀，包好，放入高压蒸汽灭菌锅中，115℃高压灭菌30分钟；
2、高压后取出，加抗原，即与1000 iu/ml青链霉素按1：1比例混合；
3、分装：摇匀后，与蛋白原液按1：1的比例按分装于高压过的玻璃瓶中；
4、预冻：将分装好的玻璃瓶放于-70℃冰箱预冻2h；
5、冻干：预冻完成后，将瓶盖拔开一些，将青霉素瓶转移到预冷过的冷冻干燥机内进行冻干；
6、冻干进行中，注意观察样品冻干的状态和结构，如形成乳白色疏松多孔的海绵状物质即可取出，放于-20℃保存备用；
7、观察各瓶的形态、外观，进行效价的测定。

8、活性测定，包括CEF成纤维细胞的培养，接种VSV病毒，以及结果的判定。

鸡传染性法氏囊病病毒X-28弱毒株的致病性试验。