不同抑制剂对果汁多酚氧化酶活性的影响

DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.024661引用格式:周亨乐,王富海,易俊洁,等.化学抑制剂对果蔬食品多酚氧化酶性质影响的研究进展[J].食品与发酵工业,2021,47(4):253-260.ZHOU Hengle,WANG Fuhai,YI Junjie,et al.Research progress on the effect of chemical inhibitors on the properties of polyphenol oxidase in fruits and vegetables[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(4):253-260.化学抑制剂对果蔬食品多酚氧化酶性质影响的研究进展周亨乐,王富海,易俊洁,程冯云,袁蕾,牛慧慧,周林燕∗(昆明理工大学农业与食品学院,云南昆明,650500)摘㊀要㊀多酚氧化酶(polyphenol oxidase ,PPO )引起的酶促褐变会导致果蔬食品色泽劣变,营养成分降低,甚至使其丧失商品价值㊂化学抑制剂对PPO 具有较好的抑制效果,并且使用方便,在果蔬食品中广泛使用,因此对它的研究具有理论和实际意义㊂该文论述了羧酸㊁抗坏血酸及其衍生物㊁含硫氨基酸㊁酚酸及其他抑制剂对PPO 的抑制作用和机理,并分析了它们在食品工业应用中的优缺点㊂同时,从分子水平上探讨了化学抑制剂处理后PPO 构象变化,以及抑制剂与PPO 的相互作用方式,得出了化学抑制剂可通过强酸作用㊁螯合作用㊁还原作用和强结合作用来导致PPO 构象变化而抑制酶活,为深入研究抑制剂对PPO 的抑制机理提供了理论参考㊂关键词㊀多酚氧化酶;酶促褐变;化学抑制剂;抑制机理;构象变化第一作者:硕士研究生(周林燕副教授为通讯作者,E-mail:zhoulinyan916@)㊀㊀基金项目:国家自然科学基金项目(31860445)收稿日期:2020-06-09,改回日期:2020-09-07㊀㊀酶促褐变是果蔬食品中普遍存在的一种现象,能够引起果蔬外观的劣变,导致果蔬的风味和营养发生变化㊂因此,在食品工业生产中使用相关技术手段对多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)进行抑制,降低褐变发生率十分重要㊂化学抑制剂因具有方便高效的特点,近年来有关其对PPO 抑制效果的报道越来越多,抑制机理的研究也日趋成熟㊂本文列举了五类化学抑制剂对PPO 的抑制作用和机理,并从分子水平上探讨了化学抑制剂对PPO 构象的影响㊂1㊀多酚氧化酶1.1㊀PPO 概述PPO 是自然界一种常见的氧化还原酶,广泛存在于各种生物中,其在食品工业有着重要的应用[1]㊂PPO 通常先以无活性的前体形式存在,其前体一般由N -端导肽㊁中间高度保守的Cu 结合区和C -端疏水区3部分组成㊂其中Cu 结合区是该酶的主要功能区,其他部分则对酶的构象㊁高级结构的形成和维持起作用㊂PPO 的活性位点在PPO 催化反应中起着重要作用㊂如图1所示,PPO 分子的活性位点有两个Cu,包括CuA 和CuB 区域,CuA 区域含3个保守的His 残基和1个Cys 残基,CuB 区域含3个或4个保守的His 残基,形成了有特定三维结构的活性部位[2]㊂不同种植物和同一植物体的不同部位㊁同一部位a -正交空间群中双核铜结合位点的三维结构;b -用tropolone 展现表面活性中心的三维结构图1㊀PPO Cu 2+活性中心[2]Fig.1㊀Binuclear copper binding site的多基因家族的不同成员之间,PPO 的分子质量不同㊂PPO 是一种寡聚蛋白分子,前体单体的分子质量为60~71kDa,而成熟单体的分子质量为40~68kDa,表明PPO 分子由无活性转变为有活性的过程中经过了肽链加工[3]㊂不同种植物之间的PPO 常常具有高度的相似性㊂研究发现苹果的PPOs 氨基酸序列与番茄㊁土豆㊁蚕豆㊁葡萄等有43%~58%的相似性[4]㊂PPO 是由核基因编码,多个基因控制,表现出多基因的家族性㊂其基因的表达比较复杂,不同种植物㊁同一植物体的不同部位及同一部位的多基因家族表达的种类及表达的量都不同㊂例如香蕉其编码的BPO1与BPO11㊁BPO34㊁BPO35之间序列同源性为50%左右,BPO34与BPO35同源性较高,达80%左右[5]㊂它们往往具有不同的底物特异性㊁表达时间和空间差异,表明PPO 参与了多种生理过程㊂1.2㊀PPO 的酶促褐变PPO 是引起果蔬酶促褐变的主要内源性酶,PPO也因参与果蔬褐变而在食品科学领域得到广泛的研究㊂如图2所示,PPO 的酶促褐变过程是指其在氧分子存在的条件下可催化单酚酶羟基化和将邻二酚氧化为邻醌;随后醌类化合物被氧化成醌衍生物,形成的邻醌与其他醌㊁氨基酸㊁蛋白质非酶聚合形成褐色化合物[6]㊂目前,主要存在3种关于PPO 酶促褐变机理的假说:酚酶区域分布假说㊁自由基伤害假说和保护酶系统假说,其中酚酶区域性分布假说更受推崇[7]㊂该假说认为在组织细胞内存在两种形式的PPO,一种是游离态多酚氧化酶(sPPO),存在于细胞质中;一种是膜结合态多酚氧化酶(mPPO),束缚于细胞膜上㊂由于正常植物组织中的多酚类物质分布在细胞液泡内,PPO 分布在各种质体或细胞质内,因此多酚类物质与PPO 难以接触,即使它们与氧同时存在也不会发生褐变㊂而细胞膜结构一旦被破坏后,mPPO 便游离出来,向sPPO 转化,sPPO 活性显著提高,表现PPO 和酚类物质的区催化活性[8]㊂通常只有这种空间隔离被打破,PPO 才表现出酶活性㊂果蔬加工及贮藏过程中的切割㊁破碎等外加条件会导致膜系统的破坏,打破区域化分布,酶和底物得以接触从而引起酶促褐变㊂图2㊀单酚酶与二酚酶氧化反应过程[5]Fig.2㊀Oxidation mechanism between monophenolaseand diphenolase1.3㊀PPO 对果蔬食品的影响PPO 引起的酶促褐变是造成果蔬劣变的主要原因之一,据报道,全球50%以上的果蔬及其加工产品的损失是由酶促褐变引起的,其对果蔬产业造成了巨大经济损失[9]㊂以目前市场上较受欢迎的NFC 果蔬汁和鲜切果蔬为例,NFC 果蔬汁的生产需先破碎后榨汁,以提高出汁率㊂在破碎和压榨过程,细胞结构被破坏,多酚类物质更易溶出,使得果蔬汁中的多酚含量显著上升,同时更易与PPO 接触,导致严重的酶促褐变发生㊂鲜切果蔬以其营养㊁方便㊁可食率达100%等特点深受欢迎,但在去皮㊁切分等加工过程中,细胞组织结构极易受到损伤,使得细胞组织与空气直接接触,加速了酶促褐变进程㊂这些在贮藏㊁运输及加工的过程中不可避免发生的酶促褐变,影响了果蔬的商业价值,降低消费者的接受率,严重阻碍了果蔬产业发展㊂因此控制酶促褐变成为果蔬产品加工过程中极其重要的一步㊂2㊀化学抑制剂酶促褐变的发生需要3个条件:底物(多酚类物质)㊁氧介质㊁PPO㊂在实际生产中想要除去食品中PPO 底物不仅困难而且不现实,因此使用抑制剂抑制PPO 活性是一种有效的手段㊂化学抑制剂对PPO 具有高效的抑制效果且使用方便,被广泛应用于果蔬产业,故对它的研究具有广泛的理论和实际意义㊂酶化学抑制剂种类繁多,其抑制机理也各不相同,本文将化学抑制剂分为以下五类进行讨论㊂2.1㊀羧酸类羧酸(carboxylic acid)作为食品组分天然存在于许多植物中,是由烃基与羧基相连构成的有机酸㊂目前发现很多羧酸类物质可作为PPO 的有效抑制剂,如柠檬酸㊁草酸㊁酒石酸和苹果酸㊂柠檬酸作为最常见的羧酸,对芒果[10]㊁苹果[11]和香蕉[12]等提取获得的PPO 抑制效果较好㊂在这些研究中柠檬酸的浓度范围较宽且大部分有效浓度范围高于10mmol /L 能抑制80%的PPO 活性㊂草酸是二元酸,对苹果[11]㊁香蕉[12]和梨[13]等提取获得的PPO 酶液抑制效果显著㊂在这些研究中草酸浓度在10mmol /L 就能有效抑制粗酶液中80%的PPO 活性,与其他结构类似的羧酸相比抑制效果更强㊂同时,羧酸应用于食品体系也有着良好的抑制效果㊂羧酸类对果蔬汁和鲜切果蔬等食品体系中的PPO 均有较好抑制效果,且大多抑制剂使用浓度范围与粗酶体系中相似㊂例如,添加0.5%~2.5%的柠檬酸于果蔬汁中能较好抑制褐变,采用1%~2%的柠檬酸浸泡鲜切果蔬能较好减少贮藏过程中颜色变化[14]㊂羧酸主要通过降低体系pH㊁螯合铜辅基等2个方面来抑制PPO活性㊂羧酸作为酸化剂能降低体系pH,导致酶变性或者使酶处于最适pH范围外[11]㊂大多果蔬PPO的最适pH值在6.0~7.4,PPO在pH<4.0时,甚至可完全失去活性㊂此外,羧酸作为螯合剂能与PPO活性位点的Cu2+相结合影响酶促反应[15]㊂草酸是食品工业中常用的金属螯合剂,与Cu2+具有较高的亲和性而形成螯合物,能有效抑制酶活性或减弱酶与底物的亲和力[16]㊂YORUK等[13]报道了草酸通过螯合Cu2+抑制梨的PPO活性,且无法通过透析得到恢复㊂利用调酸降低pH值抑制果蔬褐变,是果蔬加工中最常用的方法㊂大多数羧酸是食品行业中使用范围极广的酸化剂,添加到产品中安全健康㊁口感好,可促进食欲㊂同时由于其水溶性和脂溶性较好,易于均匀地分散于各类食品中,在食品工业中常与热水烫漂联合使用能较好抑制PPO活性,护色效果显著㊂但羧酸在产品中的添加量十分关键,添加过少抑制效果不强,添加量过大会造成产品酸化严重,影响产品风味㊂2.2㊀抗坏血酸及其衍生物抗坏血酸及其衍生物(ascorbic acid derivatives)是一种天然抗氧化剂,具有酸的性质,是近年来研究最多的亚硫酸盐替代品㊂抗坏血酸作为应用最为广泛的PPO抑制剂之一,对苹果[17]㊁李子[18]和菠萝[19]等不同来源提取的PPO都具有强烈的抑制效果㊂研究发现,大多数的抗坏血酸浓度在低于1mmol/L就能抑制粗酶液中90%的PPO酶活性,表明抗坏血酸在缓冲体系中对PPO的抑制是非常有效的㊂同时抗坏血酸在食品体系中也应用广泛,与缓冲液体系相比,食品体系中所用抗坏血酸浓度普通更高㊂抗坏血酸添加到果蔬汁中的浓度为5.7~500mmol/L,有效浓度在57mmol/L对PPO即可达到80%的抑制率;在鲜切果蔬中使用高于100mmol/L的抗坏血酸对PPO即可达到80%的抑制率,有效延缓鲜切果蔬的褐变[20]㊂此外,抗坏血酸钠㊁抗坏血酸钙㊁磷酸抗坏血酸等抗坏血酸衍生物也能较好地抑制PPO活性,如添加1%的抗坏血酸钙可有效抑制鲜切鸭梨的褐变发生[21]㊂抗坏血酸作为常用的抑制剂,其抑制作用主要是作为还原剂将酚还原成醌类物质,同时作为螯合剂与PPO的辅基Cu2+螯和,从而延缓或消除了褐变过程[17]㊂此外,还有研究表明抗坏血酸可通过和酚类物质竞争氧以减缓反应进程,其在果汁中可作为抗坏血酸氧化酶的底物在酶的催化作用下把将溶解在果汁中的氧消耗掉,从而抑制褐变[22]㊂抗坏血酸是实际生产中较为理想的抑制剂,其安全性高㊁价格低廉,在工业生产中可以广泛的应用㊂抗坏血酸除了抑制褐变,作为还原剂可降低护色液的氧含量,具有漂白色素的作用,而且还能使V C维持在一个较高的水平上,提高了果蔬产品的食用价值和外观品质,具有深远的经济意义㊂然而,在实际生产中抗坏血酸的添加量十分重要,若添加量过少,不仅不能抑制褐变,反而会引起羰氨反应造成非酶褐变;若添加量过多,会导致成品在贮存期间因氧化后所形成的酮化合物与氨化合物发生非酶促褐变反应,从而加剧成品的变色[23]㊂2.3㊀含硫氨基酸含硫氨基酸(suifur-containing amino acids)是指分子式中含有硫元素,且这些硫元素形成的巯基等化学键具有一定的生理功能㊂L-半胱氨酸是最常用的含硫氨基酸抑制剂,对芒果[10]㊁李子[18]等提取获得的PPO 具有较好的抑制效果㊂大部分研究发现L-半胱氨酸的浓度低于1mmol/L时就能对PPO粗酶液表现出90%以上的抑制效果,甚至在低于0.1mmol/L时也具有较好的抑制效果㊂同样地,L-半胱氨酸在食品体系中也能较好抑制PPO活性,使用10mmol/L以上的L-半胱氨酸处理鲜切苹果㊁梨汁等可降低80%的PPO活性㊂此外,使用乙酰基半胱氨酸和谷胱甘肽也能较好抑制鲜切果蔬的PPO活性,其浓度大多在50mmol/L 就能较好抑制PPO活性,有效延缓褐变[24]㊂目前,关于含硫氨基酸抑制PPO酶促褐变机制的研究众多,但抑制机理仍存在争议㊂以L-半胱氨酸为例,一是认为其抑制机理主要是因为L-半胱氨酸可以使多酚被氧化后生成的醌不与其他醌类㊁氨基酸和蛋白质等聚合生成络合物,而直接与其结合形成一种新的无色硫氢化合物,从而阻碍了酶促褐变反应进程;二是认为L-半胱氨酸中的SH基团对PPO活性区域的Cu2+具有很强的亲和力,能去除活性中心的Cu2+或取代与Cu紧密配合的His残基,从而改变PPO活性中心的结构使酶活降低;三是认为L-半胱氨酸并非阻止PPO氧化酚类,而是阻止酚类的聚合从而抑制褐变发生[25]㊂L-半胱氨酸是PPO良好的抑制剂,尤其是在高浓度下其抑制效果显著㊂但高浓度的L-半胱氨酸会产生令人恶心的气味,同时因其具有漂白作用,能严重破坏食品风味和外观㊂因此要想有效抑制PPO酶活性,可以考虑采用多种抑制剂联合的方法㊂抑制剂联合是果蔬加工中常用的方法之一,多为2种或2种以上复合使用,且符合食用级标准㊂近年关于L-半胱氨酸与其他抑制剂联合使用效果的研究越来越多,通常L-半胱氨酸可与抗坏血酸或适量的pH调节剂如柠檬酸㊁苹果酸㊁醋酸等既可降低pH值抑制褐变发生率,又能较好保持产品的产品风味和外观㊂2.4㊀酚酸酚酸(phenolic acids)是一类含有酚环的有机酸,水果和蔬菜中含有许多种类的酚酸,其中一部分可作为PPO的底物而引起褐变,另一部分则可对PPO有抑制作用㊂肉桂酸存在于多种植物中,具有低毒㊁良好的生理活性等特征,能有效抑制棕榈[26]㊁菠萝[19]等不同来源提取获得的PPO活性㊂在上述研究中肉桂酸的浓度低于5mmol/L可以抑制75%的PPO酶活,表明肉桂酸是一种有效的PPO抑制剂㊂同时研究发现肉桂酸衍生物对PPO也具有抑制效果,如阿魏酸㊁2-氯肉桂酸等可展现出较强的抑制效果[27]㊂此外,没食子酸㊁咖啡酸㊁曲酸也是常见的PPO抑制剂㊂尤其是曲酸在许多研究中发现其浓度低于1mmol/L时可使提取获得的PPO受到强烈抑制,甚至0.1mmol/L的曲酸就有70%的抑制率㊂曲酸具有无色无味的优点,加入果蔬汁中不改变其口味, 1mmol/L的曲酸即可较好抑制苹果汁中PPO活性,是优良的护色剂㊂酚酸大多是竞争性抑制剂,具有与酚类底物类似的结构,能够占据酶的催化中心,从而阻碍底物的进入㊂肉桂酸及其衍生物主要是通过竞争性地占据PPO活性中心的位置,与PPO中双核Cu2+螯合,抑制PPO活性㊂此外,还有研究认为有些肉桂酸衍生物可被催化氧化成醌类物质,能与酶和底物的复合体结合,从而抑制产物的生成[28]㊂曲酸㊁没食子酸等酚酸可作为螯合剂与双铜离子强烈结合,阻碍底物进入酶催化中心,抑制PPO活性㊂KAHN等[29]认为曲酸的抑制机理还可能是因为曲酸具有抗氧化性,它的酚羟基可以被还原,通过去除氧以干扰酶促反应㊂酚酸类抑制剂是PPO的良好抑制剂,但与模拟体系相比,酚酸在食品体系中的研究和应用相对较少,这可能是由于酚酸类抑制剂具有不明确的安全性和较低的水溶解度所致,因此在食品工业中较少使用此类抑制剂㊂2.5㊀其他除了上述四类抑制剂外,还有一些物质对PPO 有较好的抑制效果㊂蜂蜜是一种甜物质,研究发现蜂蜜能通过降低果汁中溶解氧的扩散速率来抑制变色,添加2.0%的蜂蜜可有效抑制PPO活性[30];据报道,洋葱的榨汁液能有效抑制苹果汁㊁鲜切苹果及莴苣的褐变,在这些食品中添加1%的洋葱榨汁液可降低70%的PPO活力,并且洋葱榨汁液经加热后会产生许多巯基化合物,巯基化合物可增强洋葱的抑制效果[31];4-己基间苯二酚(4-hexylresorcinol,4-HR)由于其无毒㊁非致突变性和非致癌特性,在食品工业中具有潜在的用途㊂GUERRERO等[32]研究发现4-HR与PPO的底物结构类似,其能优先结合到PPO的活性部位,从而阻碍酶与底物的接触,抑制褐变的发生㊂因此4-HR作为一种高效的PPO抑制剂,使用0.1%的4-HR就能降低80%的提取获得的PPO活性[33]㊂此外,杜仲叶提取物㊁原花青素㊁茶叶提取物㊁桑树皮和桑树枝提取物等均能较好抑制PPO活性,但它们的抑制机理还未明确,在食品体系中的研究较少㊂3㊀抑制剂对PPO的构象影响酶蛋白的空间结构主要依靠大量较弱的次级键以及弱相互作用共同维持,PPO活性中心和它的三维构象有关,其中任何微小变化都可能导致酶失去活性㊂越来越多的研究发现能对PPO产生强酸作用㊁螯合作用㊁还原作用及强结合作用的化学抑制剂可以通过影响PPO的构象来抑制PPO活性㊂目前常采用圆二色光谱仪㊁红外光谱仪㊁荧光光谱仪等仪器来研究酶蛋白三维结构的变化㊂圆二色(circular dichroism,CD)光谱可以反映出蛋白质或多肽链二级结构变化的信息;红外光谱可以研究分子的结构和化学键,并由此推测分子的立体构型;荧光光谱可以分析蛋白质分子在不同环境下的构象变化㊂此外,分子对接技术可以通过研究复合物中2个分子正确的结合位点和最佳取向,明确底物构象在形成复合物过程中的变化来探究抑制剂作用机理㊂3.1㊀强酸作用PPO对pH的变化敏感,高酸性环境会使酶蛋白上的Cu2+解离下来,造成PPO变性㊂柠檬酸㊁苹果酸㊁乳酸等是良好的酸化剂,即使在具有高离子强度的缓冲液中也能导致体系pH的明显下降,抑制PPO 活性㊂ZHOU等[34]研究了柠檬酸处理PPO后的构象变化,发现随着柠檬酸浓度增加,PPO二级结构中的α-螺旋含量逐渐降低,β-折叠含量逐渐增加,二级结构发生了变化㊂同样地,SHI等[35]通过CD光谱分析,发现在强酸环境下PPO的α-螺旋和β-折叠含量减少,而β-转角和无规则卷曲含量增加㊂α和β链的改变会导致多肽主链的部分延伸,从而使PPO的构象变得松散,造成构象变化㊂此外,酸性环境还会导致酶蛋白三级结构的部分破坏㊂LIU等[36]分析了柠檬酸处理PPO 的荧光光谱,发现随着柠檬酸浓度增大,PPO的荧光强度逐渐降低,最大荧光发射波长出现红移㊂强酸环境引起的PPO变性可使部分内埋的氨基酸残基暴露在更为亲水的环境中,导致荧光强度出现下降㊂同样地,方志超等[37]研究了乳酸作用PPO的荧光光谱,发现随着溶液pH的降低,PPO荧光强度也不断降低,表明乳酸处理能破坏PPO三级结构㊂静电相互作用是化学键-离子键形成的本质,是影响蛋白酶结构㊁结合特异性和生物功能的重要因素之一㊂在酚酶多肽链的不同部位,存在着酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基,因而在不同部位的侧链基团之间存在静电相互作用㊂但这种静电相互作用易受到强酸环境的影响,强酸可通过质子化和去质子化效应来改变酶的离子化状态,从而造成酶构象变化[38]㊂3.2㊀螯合作用螯合作用是将具有供电子基团的化合物与金属离子结合并形成环状结构的络合物㊂PPO活性中心包含2个Cu2+位点,在氧气的传递和底物的氧化上起到重要作用,Cu2+可作为中心离子参与螯合作用㊂草酸㊁柠檬酸㊁曲酸等是常见的螯合剂,可通过螯合作用抑制PPO活性㊂RAPEANU等[39]通过红外光谱分析,发现加入草酸后,其红外光谱强度出现增加,表明酶蛋白的骨架结构发生改变㊂严莉等[40]通过荧光光谱分析,发现随着草酸浓度增加,PPO荧光强度不断下降,并伴随着荧光猝灭㊂在正常生理条件下,PPO活性区域中的多肽链氢键网络排列规整,PPO始终维持相对稳定的状态㊂草酸分子与Cu2+螯合后,可导致酶活性区域的氢键网络发生重排,多肽链更为伸展,进而引起整体构象的改变㊂NOKTHAI等[41]通过分子对接模拟发现(图3),草酸分子大部分被掩埋进入PPO活性位点内,进入活性位点内的草酸通过氢键与Cu2+和带负电荷的His残基相互作用,键合成具有环状结构的配合物,破坏了该区域的氢键网络㊂同样地,LIU 等[42]通过CD光谱分析,发现随着曲酸浓度增加,二级结构中的α-螺旋和β-螺旋出现增加㊂同时通过荧光光谱,发现PPO荧光强度不断下降,Trp残基周围微环境的疏水性逐渐减弱㊂抑制剂与PPO螯合形成络合物的过程,可导致其活性位点中的多肽链氢键网络重排,造成了PPO天然构象不稳定,再加上活性区域的疏水性减弱,进而导致了酶构象的变化㊂图3㊀PPO与草酸分子对接模拟图[41]Fig.3㊀Docking simulation of PPO and oxalic acid3.3㊀还原作用抗坏血酸㊁L-半胱氨酸等具有还原作用的抑制剂可通过将醌还原成酚或与醌形成无色的硫醇-醌复合物,阻断了褐变产物形成抑制PPO酶活㊂SI等[43]研究了抗坏血酸作用PPO后的CD光谱,发现PPO的α-螺旋含量降低,β-折叠和无规则卷曲的含量增加,PPO二级结构发生改变;通过荧光光谱分析,发现PPO荧光不断降低,内源荧光遭到猝灭,三级结构发生改变㊂抗坏血酸能够进入PPO活性区域,引起PPO活性位点氧化还原状态的改变,对其产生的还原作用可直接引起酶构象的改变㊂SENOL等[44]通过分子对接技术研究(图4),发现抗坏血酸进入酶活区域后,与PPO活性位点Phe264㊁His263㊁Ser282和Val283的氨基酸残基相互作用,并与His178和Lys180建立氢键,形成酶-抗坏血酸(AA-PPO)复合物㊂在AA-PPO配合物结合位点处存在疏水作用,催化位点的疏水性导致活性位点发生变化㊂同样地,BISWAS等[45]通过测定L-半胱氨酸处理PPO后的内源荧光,发现L-半胱氨酸对内源性荧光有一定的亲水作用,并随着浓度增加PPO表面疏水不断增强,PPO构象发生变化㊂L-半胱氨酸的还原作用使PPO发生部分去折叠,能直接诱导疏水表面的暴露,导致PPO三级结构变化[46]㊂还原类抑制剂与PPO特异性结合后,能直接引起PPO区域活性位点上构象的变化,即表现为疏水表面的逐渐暴露,活性位点疏水性增强㊂3.4㊀强结合作用具有强结合作用的抑制剂会附着在活性位点或非活性位点形成复合物,通过空间位阻或改变蛋白质构象,抑制酶活㊂这些抑制剂大多是竞争性抑制剂,肉桂酸及其类似物可通过强结合作用来有效抑制PPO 酶活㊂图4㊀PPO 与抗坏血酸对接模拟图[44]Fig.4㊀Docking simulation of PPO and ascorbicacid diagramZHOU 等[34]研究了肉桂酸对PPO 构象的影响,通过CD 光谱分析,发现随着肉桂酸浓度增加,其负椭圆值逐渐变大,表明PPO 的有序结构出现下降;同时PPO 中的α-螺旋含量逐渐下降,β-折叠含量略微上升,二级结构发生变化;通过荧光光谱分析,发现PPO 荧光强度逐渐降低,最大吸收峰出现红移,PPO 三级结构遭到破坏㊂可见,肉桂酸与PPO 的强结合既能引起PPO 二级结构发生重排又导致PPO 三级结构发生改变㊂YU 等[47]用分子模拟分析PPO 与肉桂酸结合方式(图5),发现肉桂酸能够嵌入PPO 的疏水空腔,其苯环与His263残基形成π-π堆积,肉桂酸与PPO 结合后能形成一个牢固的复合物,破坏了Trp㊁Tyr 与铜离子之间的氢键,造成PPO 功能损失㊂同样地,CUI 等[48]研究了4-氯肉桂酸和4-乙氧肉桂酸两种肉桂酸衍生物对PPO 的荧光变化,发现两者均能对PPO 的内源荧光有猝灭作用,最大发射峰发生明显的位移,PPO 三级结构发生改变㊂肉桂酸类抑制剂与PPO 多肽链结合后,表现出强黏结作用,能破坏PPO 活性区域附近的一些氨基酸残基与Cu 2+之间的氢键,导致PPO 多肽链氢键网络结构重排,PPO 构象发生改变㊂图5㊀PPO 与肉桂酸分子对接模拟图[47]Fig.5㊀Docking simulation of PPO and cinnamic acid4㊀展望由于PPO 来源广泛,不同种类之间又存在一定的差异性,导致相同抑制剂对不同PPO 产生的抑制效果也会不尽相同㊂随着科研工作者对不同果蔬食品中PPO 的酶学研究不断深入,PPO 的性质㊁酶促褐变机理㊁各种酚类底物与PPO 的亲和力差异㊁化学抑制剂对PPO 活性的抑制机理等内容将会越来越丰富和清晰㊂目前,关于化学抑制剂对PPO 活性影响的研究较多,但是对于化学抑制剂处理后PPO 分子构象变化的研究较少㊂关于PPO 的活性位点Cu 2+的变化㊁酶促褐变机理㊁PPO 二级结构和三级结构变化以及构象变化与酶促褐变反应之间的关联等方面还有待进一步研究探讨㊂随着现代科学技术的不断发展,蛋白质组学㊁分子和动力学模拟等技术将更多的应用于PPO 研究,同时加强从分子水平上对PPO 的深入研究,可为探明酶促褐变机理提供更多新方法㊂参考文献[1]㊀MAYER A M.Polyphenol oxidase in plants and fungi:Going places?A review[J].Phytochemistry,2006,67(21):2318-2331.[2]㊀ISMAYA W T,ROZEBOOM H J,WEI J A,et al.Crystal structureof Agaricus bisporus mushroom tyrosinase:Identity of the tetramersubunits and 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毕业论文文献综述生物工程多酚氧化酶活性测定及控制1 前言多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。

本文总结了多酚氧化酶的活性测定方法以及对其活性的控制，主要研究了抑制剂对其活性的影响，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。

多酚氧化酶（PPO）作为一种植物酶类，是引起果蔬褐变的主要因素。

鲜切果蔬因组织被切分使PPO与酚类底物的接触机会增加，酚类物质被氧化成棕褐色的醌，导致产品褐变。

抑制PPO活性取决于抑制剂的性质和浓度、底物的可利用性、pH值和温度。

一些还原剂、酶类、螯合剂和蜂蜜等均已被用于防止果蔬酶褐变。

本文主要总结了抑制剂对于控制果蔬PPO活性的研究。

2 主题部分2.1 从果蔬中提取PPO（以莲藕为例）2.1.1 丙酮法（丙酮法提取所得酶液比活力最高。

适合需大量制样时使用）将莲藕洗净，去皮，切碎，加4倍量预冷至．18。

C的丙酮(w／v为1：4)捣碎，搅拌3min，抽滤，冷风吹干残渣后，混匀，得丙酮粉。

称取丙酮粉O．5 g，加入0．2 mol／L，pH为5．4的预冷磷酸二氢钠．柠檬酸缓冲液20ml，搅拌3min，8 000r／min离心10min，所得上层清液即为粗酶液。

【1】2.1.2 匀浆法（匀浆法提取的酶液没有活性）将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，抽滤。

向滤渣中加入0．05mol／L，pH5．4磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液(W／V为1：1)再次搅拌，抽滤，两次滤液合并，8 000r／min离心10rain，所得上清液即为粗酶液。

【2】2.2.3 匀浆浸提法（匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性高，且可以直接用于研究）（1）将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，4。

Characterization of Polyphenol Oxidase in Pericarp of Hylocereus undatus
ZHANG Fu-ping，LIN Xiao-qiong
(Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)
25 40
20
50
30
60
15
0 10 20 30 40 50 60 70 80
温度(℃)
图 ５ 温度对 ＰＰＯ 活力的影响 Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＰＯ
温度对多酚氧化酶活性有双重影响，一方面，温 度升高加快酶催化反应速度；另一方面，促使酶蛋白变 性，因此温度对多酚氧化酶的影响是以上两种对抗效应 的综合反映。在 10～70℃温度范围内，对 PPO 活性进 行检测。由图 5 可以看出，火龙果果皮 PPO 酶活性在 40℃有一个高峰期，说明 PPO 活性接近 40℃时较高，在 5 0 ℃是略低，之后又随着温度上升而急剧下降。说明 火龙果果皮多酚氧化酶的耐高温能力较差。但由于高温 会使火龙果中的营养成分损失，特别是抗坏血酸受热容 易分解, 因此在果实采后保鲜方面应综合考虑多种因素来 控制火龙果的褐变。 2.6 抑制剂对 PPO 活力的影响
1.3.1 PPO 酶液的制备 称取新鲜火龙果果皮 10g 于研钵中，按照 1:3(W/V)
的比例量取 30ml pH7.2 的磷酸缓冲液，在研钵中加入 pH7.2 的磷酸缓冲液 5ml，低温快速研磨至匀桨，再加 入余下的 25ml 磷酸缓冲液，于 6000r/min，4℃高速冷 冻离心机离心 10min，汲取上清液，即为粗酶提取液， 0 ～4 ℃保存备用。

苹果多酚氧化酶的提取及其抑制作用的研究苹果多酚氧化酶（APX）是一种由植物细胞中合成的抗氧化酶，能有效抑制植物体内氧化反应的过程。

近年来，苹果多酚氧化酶的应用越来越广泛，并受到了国内外科学家的广泛关注。

本文旨在讨论苹果多酚氧化酶的提取方法及其抑制作用的研究。

苹果多酚氧化酶的提取方法但凡分两种：一种是滤液法，另一种是逆流色谱（RP）法。

滤液法是利用生物滤液技术把APX从植物细胞中提取出来，如发酵液法、冻干滤液法等。

RP法是将提取物在离子交换树脂上进行分离纯化，其中使用的液体可以是水系溶剂或乙醇系溶剂。

苹果多酚氧化酶的抑制作用是一个复杂的过程，有许多因素可以影响其抑制效果，例如pH值、温度、氧含量和溶剂等。

抗氧化活性受植物体内多酚氧化酶的活性水平影响，及其他一些因子如抗氧化物质的形式，植物细胞中活性水平的不同，及其他受抑制剂抑制的影响及其种类。

在实验中，研究者可利用苹果多酚氧化酶的抑制作用进行实验，以反映植物体内抗氧化酶的活性水平，通过合成的抑制物，可以准确的测定植物体内的抗氧化酶的活性水平。

同时，也可以利用抑制剂作为抗氧化剂，实验研究APX的抗氧化活性，以及其抑制作用的实验研究。

综上所述，苹果多酚氧化酶的提取及其抑制作用的研究对我们了解植物体内氧化反应以及防止植物体内氧化损伤有着重要意义。

苹果
多酚氧化酶的提取方法和抑制作用的实验研究，将有助于我们深入了解植物体内氧化反应的机制，并有助于我们开发有效的植物抗氧化剂。

抑制剂对黑鸡心葡萄多酚氧化酶活性的影响郭艳萍;刘美林;贺东亮;赵金安【摘要】研究了不同浓度梯度的亚硫酸氢钠、柠檬酸、EDTA、抗坏血酸4种抑制剂对清徐黑鸡心葡萄多酚氧化酶(PPO)活性的抑制效果,旨在单因素试验的基础上,通过正交试验进一步优化黑鸡心葡萄在贮藏、运输过程中防褐变添加剂的配方.结果表明:柠檬酸、EDTA、抗坏血酸对PPO活性表现出较好的抑制效果,3种抑制剂联合作用的最佳组合为A1 B2 C2,即柠檬酸0.04 mmol · L-1,EDTA0.08 mmol·L-1,抗坏血酸0.08 mmol·L-1. PPO活性的抑制率达到85.67％.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(034)005【总页数】4页(P477-480)【关键词】清徐黑鸡心葡萄;多酚氧化酶;活性;抑制剂【作者】郭艳萍;刘美林;贺东亮;赵金安【作者单位】太原工业学院环境与安全工程系,山西太原030008;太原工业学院环境与安全工程系,山西太原030008;太原工业学院环境与安全工程系,山西太原030008;太原工业学院环境与安全工程系,山西太原030008【正文语种】中文【中图分类】TS201.3黑鸡心葡萄是山西清徐特有的葡萄品种，果穗大，果粒密实，形似鸡心，色泽黑紫。

果肉呈淡绿色且柔软多汁，含糖量17%左右，含酸量1.5%左右，果实可以生食、制汁、制酱、制果醋。

在黑鸡心葡萄加工、贮运过程中，酶促褐变是主要的难题之一。

酶促褐变的发生由多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶等引起，其中发挥主要作用的是多酚氧化酶。

多酚氧化酶属严格的质体酶，由核基因编码，多基因调控，参与生物氧化，是一种含Cu2+的末端氧化酶。

在PPO的作用下组织中的酚类物质被氧化成醌类物质，醌可在无酶参与的条件下被氧化或者自身聚合形成黑色素。

目前，研究抑制酶促褐变的方法主要有加热、高压、CO2冷处理、磁场作用、添加PPO酶活抑制剂等[1～3]，其中最经济最有效的方法当数添加PPO酶活抑制剂。

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。

酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。

其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。

多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。

因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O2——————→邻醌＋H2O三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。

2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

分析检测不同抑制剂对鲜榨香蕉汁中多酚氧化酶活力的影响梅　阳，吴　燕（信阳农林学院，河南信阳 464000）摘　要：本文研究了草酸、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸及抗坏血酸4种单一抑制剂对香蕉中多酚氧化酶的抑制效应，筛选出效果最佳的抑制剂。

结果表明，单一抑制剂对多酚氧化酶的抑制能力依次是0.3%抗坏血酸＞0.2%草酸＞0.5%柠檬酸＞0.6%乙二胺四乙酸二钠，抑制率分别为85.4%、76.8%、73.9%、71.9%。

关键词：抑制剂；鲜榨香蕉汁；多酚氧化酶Effects of Different Inhibitors on the Activity of Polyphenol Oxidase in Fresh Pressed Banana JuiceMEI Yang, WU Yan(Xinyang Agriculture and Forestry University, Xinyang 464000, China) Abstract: In this paper, the inhibition effect of oxalic acid, disodium ethylenediamine tetraacetic acid, citric acid and ascorbic acid on polyphenol oxidase in banana was studied, and the best inhibitor was selected. The results showed that the inhibition ability of single inhibitor on polyphenol oxidase was as follows: 0.3% ascorbic acid＞0.2% oxalic acid＞0.5% citric acid＞0.6% ethylenediamine tetraacetic acid disodium, and the inhibition rates were 85.4%, 76.8%, 73.9%, 71.9%, respectively.Keywords: inhibitor; freshly squeezed banana juice; polyphenol oxidase香蕉不仅可以补充人体所需的营养成分，还具有促进肠道蠕动、增强免疫力、预防心血管疾病以及抗抑郁等作用[1-2]。

在图 1 中，谷胱甘肽和半胱氨酸的抑制曲线相交于 一点，说明二者的抑制效果在某一相同浓度时的抑制效 果相同，而在这个浓度之前，二者的抑制效果均不错。 为了进一步比较二者的抑制效果，利用正交分析的方法 来观察在多种不同抑制剂同时作用下对多酚氧化酶的抑
由表 2 可知，影响苹果梨中多酚氧化酶活性的因素 顺序为 A ＞ C ＞ B 。在此正交试验中，酶的活力最 低为最佳，所以各抑制剂的用量最佳配比为 A3B3C2， 即 L- 谷胱甘肽浓度为 140μmol/L、亚硫酸钠浓度为 700 μmol/L，L- 半胱氨酸注浓度为 150μmol/L。 2.3 谷胱甘肽对苹果梨中多酚氧化酶的抑制效果
3102由正交试验得到谷胱甘肽对苹果梨中多酚氧化酶活性影响最大为观察谷胱甘肽对苹果梨中多酚氧化酶抑制的效果将苹果梨去皮取两片大小相等的果肉一片浸在10mmoll的谷胱甘肽溶液中一片浸在蒸馏水中浸泡1后取出暴露在空气中观察褐变情况并拍照片记录见图可知浸泡后1h试验组表面部分开始褐变小部分表面颜色变深而对照组无明显变化
were evaluated according to residue enzyme activity. Subsequently, to obtain the optimal inhibitory effect, the above inhibitors
were compounded and the optimal formulation was investigated using orthogonal array design. Results showed that glutathione
制效果，最终确定影响酶活性的最主要因素。正交试 验结果见表 2 。
表 2 L9(33)正交试验结果 Table 2 Results of L9(33) orthogonal array design

不同抑制剂对石榴多酚氧化酶的影响赵丽华【摘要】There are abundant polyphenols in pomegranate leaves. The aim of this study was to inhibit activity of polyphenol oxidase (PPO) in pomegranate leaf. Polyphenol oxidase inhibitors were studied,such as β-mercaptoethanol (BME), polyvinylpyrrolidone (PVP), sodium bisulfite (NaHSO3 ) and sodium tetraborate (Na2B4O7). The results showed thatthe inhibition rate of 2% PVP +1% BME inhibitors combination was 26%for PPO activity in pomegranate leaf, the inhibition rate of 4% PVP + 6% BME inhibitors combination was 45%, the inhibition rate of 4% PVP + 1% BME + 1. 5×10-2 mol/LNaHSO3 inhibitors combination was 78%, and inhibition rate of 4% PVP +1% BME + 1. 5×10-2 mol/L Na2B4O7 inhibitors combination was 100%, therefore, 4% PVP + 1% BME + 1. 5 × 10-2 mol/L Na2 B4O7 inhibitors combination was the best PPO inhibitor.%石榴叶片富含多酚物质,为抑制石榴叶片中多酚氧化酶(PPO)活性,以β-巯基乙醇(BME)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、亚硫酸氢钠(NaHSO3)、四硼酸钠(Na2B4O7)为PPO抑制剂进行研究.结果表明:2％PVP+1％BME对石榴叶片中PPO活性的抑制率为26％,4％PVP+6 ％BME的抑制率为45％,4％ PVP+1％BME+1.5×10-2 mol/L NaHSO3的抑制率为78％,4％PVP+ 1％BME+ 1.5×10-2mol/L Na2B4O7的抑制率达100％.因此,4％ PVP+1％BME+1.5×10-2 mol/L Na2B4O7为最佳PPO抑制剂组合.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2013(041)002【总页数】3页(P58-60)【关键词】石榴;多酚氧化酶;活性;抑制剂【作者】赵丽华【作者单位】西昌学院农业科学学院,四川西昌615013【正文语种】中文【中图分类】S665.4石榴（Punica granatumL.）为石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica）落叶灌木或小乔木，在热带则为常绿树，原产伊朗、阿富汗、印度等中亚一带。

关 键 词 ：澳 洲 青苹 ；多 酚氧 化酶 ；活 性 ；抑 制 剂 中图 分 类 号 ：Ｔ２ １２＋ Ｓ０． ５ 文 献 标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１０ ０ ６—２ １ （０ １ ０ Ｏ ６ ０ ５ ３ ２ １ ）１一 １０— ４
Ｔｈ ｎ ｌｅ ｃ ｓ ｏ ｉｅｒ ｎ ｎ ｉｉ ｓ ｏｎ ｐ Ｉｐ ｅ ＯＯ ｉａ ｅ ｅ ｉｆ ｎ ｅ ｆｄｆ ｅ ｔｉｈｂｔ Ｏｙ ｈ ｎ ｌｘｄ Ｓ ｕ ｆ ｏｒ
Ｃ ｉａＦ ｏ ｄ ｉｖｓ 验 研 究 ｈｎ ｏ ａ ｄｔ ｅ Ａ ｉ 试
中 国食 品添 加剂
不同抑制剂对澳洲 青苹 中多酚氧化酶活性的影 响
李佩艳 ，刘建学 ，徐 宝成 ，罗登林 ，仇 农 学
（ ．河南 科技 大学 食 品与生 物工程 学 院 ，洛 阳 １ ４ １０ ； ７０ ３ ７０ ６ ） １０ ２
Байду номын сангаас
ａ ｔ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｍｉ ｐ ｌ ｃ ｉ ｔ ｉ ｒ ｎ ｙ ｓ ｔ ａ ｐｅ ｖｙ ｈ
Ｌ ｅ－ａ Ｉ ｉｎｘ ｅ ，Ｘ ａ －ｈ ｎ ＵＯ Ｄｅ ｇｌ Ｉ ｏ ｇｘ ｅ ＩＰ ｉ ｎ ，Ｌ Ｕ Ｊａ －ｕ Ｕ Ｂ ｏｃ ｅ ｇ ，Ｌ ｎ —ｎ ，Ｑ Ｕ Ｎ ｎ －ｕ 。 ｙ ｉ
青苹中 Ｐ Ｏ活性抑制效果最好 ，最高抑制率为 ７ ． ８ Ｐ ８５ ％。复合 抑制剂对澳 洲青 苹 中 Ｐ Ｏ抑制效果 明显 ，最佳 Ｐ
复合抑制剂组合为亚硫 酸氢 钠 ２ ｍ ／ ｇ ５ ｇｋ 、抗 坏血酸 １５ ｇ ｋ 、柠檬酸 ６０ ／ ｇ ２ｒ ／ｇ ａ ０ ｍｇｋ ，抑制 率能达 ９ ． ９ ０ ０ ％。
ｍ ｘ ｄ ｉ ｉｉ ｒｏ ｏ ｐ ｅ ｏ ｏｉａｅ ｗ ｓｏ ｔ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｅ ｐ ｒ ｎ ｅｕｔ ｓ ｏ ｅ ｈ ｔａ ｄｎ ０ ＃ ｋ Ｎ Ｈ Ｏ ｒ ｉ ｈｂｔ ｆＰ ｌ ｈ ｎ ｌ ｘｄ ｓ ａ ｂａ ｅ ． ｈ ｘ ｅ ｍｅ ｔ ｓｌ ｈ ｗ ｄ ｔａ ｄ ｉｇ ５ ｍ ｇ ａ Ｓ ３ｏ ｅ ｎ ｏ ｙ ｉ ｉ ｒ ｓ

褐变抑制剂对苹果多酚氧化酶抑制机理研究易建华;董新玲;朱振宝;赵雪萌【摘要】为研究不同褐变抑制剂对苹果多酚氧化酶(PPO)活性的抑制机理,采用磷酸缓冲液构建苹果汁模拟体系,选取苹果中含量较多的酚类物质绿原酸作为试验对象,以磷酸缓冲液为苹果汁模拟体系,选取4-己基间笨二酚(4-HR)、草酸、苯甲酸和对甲氧基苯甲酸为抑制剂,通过模拟试验研究抑制剂对绿原酸模拟苹果汁酶促褐变特性的影响,揭示抑制剂对苹果汁PPO的作用机理.结果表明,抑制剂对PPO的抑制机理差异较大,其中4-HR和草酸对PPO的抑制作用为竞争性抑制,植酸为混合性抑制,而苯甲酸为非竞争性抑制.该研究可为利用抑制剂控制苹果汁褐变提供理论依据.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2015(031)004【总页数】4页(P122-125)【关键词】苹果汁;褐变抑制剂;酶促褐变;PPO;绿原酸【作者】易建华;董新玲;朱振宝;赵雪萌【作者单位】陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021【正文语种】中文苹果汁是人们喜爱的果蔬汁之一，近年来，中国苹果汁的产量增加很快。

在世界贸易中，浓缩苹果汁的贸易量逐年提高［1］。

然而在加工和贮藏的过程中，苹果汁易发生褐变反应，由诱人的金黄色变成棕褐色，色值下降、感官品质劣变，营养价值降低［2］。

果汁的褐变主要是由酶促褐变引起的，这一直是采后生理研究的重点。

酶促褐变是在氧气参与条件下，果蔬中的多酚物质经PPO催化变色所致［3］。

PPO是发生酶促褐变的主要酶，存在于大多数果蔬中。

鉴于PPO对苹果汁品质的不利作用，果汁生产过程中常采用抑制剂抑制PPO的活性，从而达到控制褐变的目的，因此，研究褐变抑制剂对苹果多酚氧化酶的抑制机理具有重要意义。

酶促褐变的发生需要3个条件，即适当的酚类底物、酚氧化酶和氧。

毕业论文开题报告生物工程多酚氧化酶活性测定及控制一、选题的背景、意义多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。

本研究就PPO的活性和影响该酶作用的因素进行阐述，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。

二、相关研究的最新成果及动态2.1鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化从鲜切藕中粗提多酚氧化酶，并通过硫酸铵盐析沉淀，DEAE-SepH-Arose离子交换柱层析以及PHenyl SepHArose 6FAsT Flow疏水柱层析进行纯化后，经SDS-PAGE电泳确定为单一条带，表明该酶已被纯化到电泳均一。

在整个过程中，该酶纯化了95．66倍，产率为2．4％。

同时研究表明，鲜切莲藕组织中PPO相对分子质量在65 900～66 100之间。

2.2 不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较以邻苯二酚和酪氨酸为底物所测PPO活性极显著相关,邻苯二酚所测活性强,但酪氨酸所测活性的变异系数大。

面粉PPO活性和面粉及面制品色泽的变化相关性最强,但籽粒和全麦粉中的PPO活性高,变异系数大。

2.3 PPO活性与小麦粉主要理化指标的关系PPO活性与小麦粉白度成极显著负相关性,与灰分含量成极显著正相关性;前路粉流PPO 活性比后路粉流低;物料含皮较多的在线粉流PPO活性高;物料来源于小麦胚乳外层的粉流PPO活性高。

2.4 核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制在抑制PPO活性方面,PVP作用最明显,其次是NA2S2O3、AGNO3。

2.5 石榴果皮中的多酚氧化酶(PPO)活性测定的最佳试验条件以邻苯二酚为底物时,底物浓度宜大于20mmol/L,其最适波长为420nm,最适pH值为6.8,最适温度为50℃,反应时间不宜超过20min,反应完成后在20min后测定PPO的活性最为稳定。

抑制剂NAHSO4的有效抑制浓度为0.8mmol/L。

2.6 纯化的莲藕多酚氧化酶(PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化园二色谱分析表明莲藕PPO主要含有α一螺旋和β一折叠结构。

雪莲果多酚氧化酶活性及褐变控制的研究史云东;贾琳;李祥;李淑英;申太波【摘要】以雪莲果为原料,采用丙酮酸缓冲液提取、硫酸铵提纯法,得到一种活性较高的多酚氧化酶,并对其活性进行了研究.研究发现:环境温度、介质pH值、抑制剂和底物浓度对多酚氧化酶的活性有一定的影响,反映了多酚氧化酶对反应介质的依赖关系,提出在雪莲果加工过程中,可通过钝化酶活性、抑制酶促反应、驱氧处理和复合抑制等途径控制雪莲果酶促褐变.【期刊名称】《粮油食品科技》【年(卷),期】2011(019)002【总页数】4页(P46-49)【关键词】雪莲果;多酚氧化酶;活性;褐变;抑制剂【作者】史云东;贾琳;李祥;李淑英;申太波【作者单位】玉溪师范学院资源环境学院,云南,玉溪,653100;玉溪师范学院资源环境学院,云南,玉溪,653100;陕西科技大学化学与化工学院,陕西,西安,710021;玉溪师范学院资源环境学院,云南,玉溪,653100;玉溪师范学院资源环境学院,云南,玉溪,653100【正文语种】中文【中图分类】TS201.1Abstract:A kind of active polyphenol oxidase was obtained from smallanthus sonchifolius by extraction and purification.The activity wasstudied.The result showed that the environmental temperature，pH of the medium，the inhibitor and the concentration of substrate had some impact on the activity of polyphenol oxidase，which meant that polyphenol oxidase was dependent on reaction medium.The enzymatic browning can be controlled by passivating the enzyme activity，restraining the enzymatic reaction，displacement of oxygen treatment and so on during process.Key words:smallanthus sonchifolius;polyphenoloxidase;activity;browning;inhibitor雪莲果，学名菊薯(Smallanthus Sonchifolius)，原产南美洲安第斯山脉。

山竹果皮多酚氧化酶酶学特性及抑制效应的研究张福平;张少英【摘要】多酚氧化酶是酶促反应的关键酶,研究了山竹果皮中多酚氧化酶的活性及不同抑制剂的抑制效果.结果表明:山竹果皮多酚氧化酶的最适pH为5.5,最适温度为30℃,底物浓度与酶活性成正相关;抗坏血酸、亚硫酸氢钠、四硼酸钠、柠檬酸等对该酶表现出不同的抑制作用,抑制作用大小为抗坏血酸＞亚硫酸氢钠＞四硼酸钠＞柠檬酸,抗坏血酸的浓度越高,对酶的抑制效果越明显.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2011(038)008【总页数】3页(P80-82)【关键词】山竹果皮;多酚氧化酶;活性;抑制剂【作者】张福平;张少英【作者单位】韩山师范学院生物系,广东潮州 521041;韩山师范学院生物系,广东潮州 521041【正文语种】中文【中图分类】TS255.36山竹（Garcinia mangostana L.）又称山竹子，原名莽吉柿、凤果，为藤黄科藤黄属种间杂交的异源多倍体果树[1]，原产马来西亚，现分布于菲律宾、泰国、缅甸、印度等热带地区。

我国海南、广西、广东、福建、云南等地也有种植[2]。

山竹果实可食部分占29%～45%，果皮紫褐色，占单果鲜重的52%～68%。

果皮中含有大量的粗纤维和果胶；此外，研究表明山竹果皮还含有丰富的植物多酚类物质，可以入药。

山竹果皮被广泛用于腹痛、腹泻、痢疾、感染性创伤、化脓、慢性溃疡等疾病治疗和抗溃疡、抗炎、抗白血病和败血病等[3]。

山竹作为一种具有发展潜力的热带水果，素有“果中皇后”之称，越来越受到人们的重视，目前已开展了很多关于山竹及其生物活性的研究 [4-6]。

多酚氧化酶（PPO）是植物体中广泛分布的核基因编码的质体铜金属酶，在细胞质中合成。

受伤果蔬组织中发生的酶褐变现象主要是由于PPO催化富含在果实中的酚类物质的氧化反应所引起的。

因此，开展PPO的纯化及其特性研究，受到了国内外学者的广泛关注[7-11]。

然而，迄今为止，尚未发现有关山竹果皮PPO特性研究的报道。

一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。

酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。

其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。

多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶（polyphenoloxidase, PPO）又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等.是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶•普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与02氧化形成醌，使组织形成褐变.以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。

因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410 nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的0D值产生变化，通过0D值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）+ 1 / 2O2 -------------------------------- 邻醌+ H2O三、试验材料、试剂及试验用品1. 材料：马铃薯块茎。

2. 仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3 .试剂：0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L 邻苯二酚；0.1mol/L 磷酸氢二钠；0.1mol/L 磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA ）；10mmol/L 亚硫酸钠四、实验方法：1•多酚氧化酶的提取取0.5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在4C下离心（8000r/min）5min,取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

余甘子果实多酚氧化酶活性影响因素研究郑丽平;丘春秀;陈晓虹;王惠敏;张福平【摘要】多酚氧化酶（PPO)是酶促褐变的关键酶，以余甘子（Phyllanthus emblica)果实PPO为研究对象，采用分光光度法研究余甘子果实PPO作用的最适底物，同时探究反应体系pH、反应温度、底物浓度、抑制剂对余甘子果实中PPO活性的影响。

结果表明，余甘子果实PPO作用的最佳底物为焦性没食子酸，最适pH为6.0，最适反应温度为10℃，底物最佳浓度为0.14 mol/L，抗坏血酸（VC)、柠檬酸、亚硫酸钠、L-半胱氨酸4种抑制剂对余甘子果实PPO活性均表现出不同程度的抑制作用，其中抗坏血酸对余甘子果实PPO活性抑制效果最好。

%Polyphenol oxidase (PPO﹚ was the key enzyme of enzymatic browning. The optimal substrate to PPO of Phyllanthus emblica and effects of pH,temperature,concentration of substrate and inhibitor on PPO activity were studied with spectrophotometry. The results showed that the optimal substrate was pyrogallic acid. The optimal pH, temperature and concentration of substrate were 6.0, 10℃ and 0.14 mol/L, respectively. Vitamin C, citric acid, Na2SO3 and L-Cysteine had inhibition effects on PPO activity in different degree. Vitamin C had the best inhibition effect on PPO activity in the fruit of phyllanthus emblica.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2014(000)007【总页数】4页(P1621-1624)【关键词】余甘子(Phyllanthus emblica);多酚氧化酶(PPO);活性;抑制剂【作者】郑丽平;丘春秀;陈晓虹;王惠敏;张福平【作者单位】韩山师范学院生物学系，广东潮州521041;韩山师范学院生物学系，广东潮州 521041;韩山师范学院生物学系，广东潮州 521041;韩山师范学院生物学系，广东潮州 521041;韩山师范学院生物学系，广东潮州 521041【正文语种】中文【中图分类】R284.1;Q946.5余甘子（Phyllanthus emblica）属大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属植物，其果鲜食酸甜酥脆而微涩，初食味酸涩，良久乃甘，故名“余甘子”。

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黄皮多酚氧化酶活性的影响因素分析
作者：张福平陈桂茂陈蔚辉
来源：《湖北农业科学》2009年第06期
摘要：研究了pH值、温度、底物浓度及抑制剂等因素对黄皮果实中多酚氧化酶(PPO)活
性的影响。

结果表明，黄皮PPO具有同工酶，PPO的最佳底物浓度为0.14mol·L-1，最适pH值为7.0，最适温度为40℃，当温度高于60℃时，PPO的活性明显降低，亚硫酸钠、抗坏血酸、柠檬酸、L-半胱氨酸等4种抑制剂对黄皮PPO的詹性表现出不同的抑制作用，抑制效果为亚
硫酸钠＞抗坏血酸＞柠檬酸＞L-半胱氨酸，其中，抗坏血酸随着浓度的增加抑制效果越好，抑制率不断升高。

关键词：黄皮；多酚氧化酶；活性；抑制剂
中图分类号：S663.9；SQ554+.9
文献标识码：A。