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第五章发酵工业的种子制备
1.优良种子应具备的条件(p78)
a.生长活力强，延迟期短；
b.生理状态稳定；
c.浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求;
d.无杂菌污染，保证纯种发酵；
e.适应性强，生产能力稳定
2.种子制备(p79)
a.实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等)或液体摇瓶培养
b.生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养
3.种龄和接种量(p80)
接种龄:种子罐中培养的菌体移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间
–接种龄以处于对数生长期的菌丝最为合适。
菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。
–细菌最适接种龄7-24h，霉菌16-50h，放线菌21-64h，同一菌种不同批次培养，得到的种子质量也不完全一致。
接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体的体积的比例
大多数抗生素发酵：7～15% ，有时可达20～25%,
有机酸发酵：10%
谷氨酸发酵（棒状杆菌）：1%
肌苷酸发酵1.5～2%
制霉菌素发酵0.1～1%
4.种子罐级数确定方法
a.通常检测的培养液中参数
b.pH是否在种子要求的范围之内
c.糖、氨基氮、磷酸盐的含量
d.菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观
e.有无杂菌污染
f.其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾气等。
发酵工程实验五一级种子的制备《发酵工程实验》实验五、一级种子的制备一、实验目的1、了解发酵工业菌种的制备过程及质量控制。
2、熟悉发酵实验的一级菌种制备。
二、实验原理菌种制备的主要手段是扩培，其出发点是尽可能培养出高活性的、能满足大规模发酵需要的纯种。
由于现代生产菌种的生产性能已非常高，因此，菌种在培养过程中自发突变往往以负向突变为主，加上平时操作中可能有污染，导致发酵菌种容易退化。
因此，菌种的管理主要有两点：分离纯化和扩大培养。
前者目的为分离出单细胞菌落，保证菌种的性能稳定。
后者目的是为发酵生产提供充足的高活性菌种，分斜面菌种、一级菌种和二级菌种。
在进行各级菌种的扩培时，菌种的质量要达到发酵要求。
比较简单的做法是用显微镜观察细胞的形态是否正常、测定种子培养基的pH 值是否正常及细胞生长繁殖活力等。
三、实验器材与试剂1、菌种实验二中筛选到的-淀粉酶产生菌(酵母)。
2、培养基（W/V）（1）斜面培养基（已制备）（2）摇瓶种子培养基：蔗糖20g/L，蛋白胨5.0g/L，磷酸氢二钠4.0g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH为5.0-5.5。
250ml 三角瓶中装培养基50ml，8层纱布封口，0.1MPa 灭菌20min（现用现配）。
四、实验步骤1、斜面接种挑取保藏菌种接种到斜面培养基上，28℃培养24h。
仔细观察斜面菌苔生长情况（菌苔的颜色、边缘等特征是否正常），有无感染杂菌。
2、镜检在无菌条件下，挑取斜面菌苔少许，在载玻片上制成涂片，在显微镜下检查菌苔形态特征，大小、均匀情况。
3、摇瓶培养挑取经镜检确定后的活化斜面菌苔3-5环，接入上述液体培养基中，28℃恒温摇床培养(180rpm)，培养12h。
观察摇瓶菌液外观稠度、静置沉降情况。
镜检菌液中菌体细胞的形态是否正常（大小均匀程度等）及测定培养液中pH。
五、注意事项1、出现污染征象的斜面培养活化菌苔坚决不能使用。
2、菌种的污染，势必导致发酵的失败，轻者产量降低，严重的不积累产物。
实验一发酵种子的制备【课前预习】发酵种子制备的方法有哪些？【目的要求】1. 了解实验室种子制备过程。
2. 掌握实验室不同菌种种子生产方法。
【基本原理】实验室种子制备过程包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养。
不同菌种其具体制备方法不同，其过程如下图。
黑曲霉发酵生产柠檬酸实验中黑曲霉种子的制备一般包含两个过程，第一个过程为种子的活化，即斜面种子制备（斜面种子也可直接用于摇瓶发酵的种子）。
第二个过程为种曲的制备，以便为下一步摇瓶发酵提供大量活化的黑曲霉孢子。
种子扩大培养过程【实验用品】1. 实验主要仪器设备超净工作台、恒温培养箱、灭菌锅、分析天平、试管、三角瓶（500mL）2. 材料菌种：黑曲霉（本实验室保存）培养基：黑曲霉活化（保存）培养基：斜面培养基，麸皮培养基。
【方法步骤】1．斜面种子制备：1.1 称量配料斜面培养基（马铃薯琼脂培养基）马铃薯（去皮）200g，蔗糖（或葡萄糖）20g，琼脂20g，水1000mL，配制方法如下：将马铃薯去皮，切成约2cm2的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，再补足至1000mL，自然pH。
霉菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖。
1.2 培养基灭菌、摆斜面1.2.1将称量好的培养基以高压蒸汽灭菌法灭菌，保持121.3℃，15-20min。
1.2.2 摆斜面。
琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55℃-60℃时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。
搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。
1.3 接种1.3.1点燃酒精灯将菌种和斜面培养基的两只试管平行放在左手上，用拇指与其它四指夹住，并使中指位于两试管之间，两试管的管口齐平。
1.3.2 用右手先将棉塞拧转松动，并稍拉出一些，以利接种时拔出。
1.3.3 右手持接种针，在酒精灯外焰灼烧将，针头以上凡是接种时可能进入试管的部分，均应用火灼烧。
1.3.4 用右手的小指与掌间拔掉左手上两只试管上的棉塞，同时迅速将试管口在酒精灯上烧灼3秒钟左右，使管口上可能沾染的少量杂菌得以烧死。
第五章发酵工业的种子制备内容提要•种子制备原理和技术•影响种子质量的因素•种子质量的控制措施•工业微生物培养的类型一、种子扩大培养1、种子扩大培养的任务工业生产规模的增大需要种子就增多种子的扩大培养种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种数量足够的、纯的培养物。
2、菌种扩大培养的目的为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子。
因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。
将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。
对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。
对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢来决定种子扩大培养级数。
抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常常用三级种子扩大培养，即将种子罐中之菌丝移植到较大的种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中，这种流程称为三级种子四级发酵一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵，如链霉素生产。
有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵。
而谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌，生长繁殖速方式很快，所以采用二级发酵。
一级种子二级发酵的流程如下：斜面菌种→一级种子摇床培养→二级种子罐培养→发酵罐二、种子制备原理与技术种子培养：指冷冻干燥管、沙土管中处于休眠状态的工业菌种，接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养，而获得一定数量和质量的纯种的过程。
其中的纯培养物就称为种子。
不同的发酵产品和菌种，种子制备的方法与条件不同。
要根据目的菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得优良的种子。
1、优良种子应具备的条件①、菌种细胞的生长活力强，转移至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；②、菌种生理状态稳定（如菌丝生长速率、种子培养液的特性等）；③、菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求；④、无杂菌污染，保证纯种发酵；⑤、菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
2、种子质量的判断方法由于种子在种子罐中的培养时间短，可供分析的参数很少，使种子的内在质量很难控制。
在种子培养过程中通常测定的参数有以下几种：①、检测种子培养液的PH是否在这种要求的范围；②、检测种子培养液中的糖、氨基酸。
磷酸盐的含量；③、检查种子培养液中菌丝形态、菌丝浓度和培养基外观（色泽、气味、浑浊度、颗粒等）；④、检查有无杂菌污染；⑤、其它参数（接种前某些酶活力、种子罐的溶氧和尾气等）。
在典型的种子培养过程中，根据参数的变化，可将整个培养过程分为两个阶段：第一阶段：25h前，属于种子萌发阶段；特征：大量的营养被摄入胞内，细胞内含物增加，体积增大，但菌体的生长繁殖较少，尾气信号为零。
监测得胞外还原糖与氨基氮的变化速率出现高峰。
第二阶段：25h后，尾气信号CO2释放速率（CER）、摄氧率（OUR）以及呼吸商（RQ）都出现快速增长的趋势，镜检发现菌体数量大增，出现了代谢的特征变化。
特征：RQ、PH的变化以及菌丝形态的变化。
二. 种子扩大培养(制备)阶段实验室种子的制备生产车间种子制备①、将少土管或冷冻干燥管中的种子接种到斜面培养基中进行活化；②、将生长良好的斜面孢子或菌丝，转接到扁瓶固体培养基或摇瓶液体培养基中扩大培养。
完成实验室种子制备。
③、将扩大培养的孢子或菌丝体接种到一级种子罐，制备生产用种子。
如有需要，可再转接到二级种子罐进行扩大培养。
完成生产车间种子制备。
④、制备好的种子转种至发酵罐中进行发酵。
1、实验室种子的制备：e.g 产黄青霉菌原始菌种斜面试管获得孢子250ml 茄子瓶（大米或小米）25 ~28 ℃，4~14天成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 ℃冰箱保存）。
对于不产孢子的赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用大米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。
产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S．griseus），产卡那霉素的卡那链霉菌（S．kanamyceticu），可以用摇瓶液体培养法，孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作为种子。
不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般采用斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞悬液再接种。
以营养细胞进行种子培养：e.g. 谷氨酸生产菌原始菌种（出发菌种）固体试管斜面（32 °C ，18~24小时）三角瓶培养（摇床）(flask culture)种子罐培养e.g. 酵母原始菌种（出发菌种）10ml 麦汁试管250ml 三角瓶培养（27 °C ~28 °C ，3天）（25°C，2天）5~10 L卡氏罐（15 °C ~20 °C ，3~5天）2、生产车间种子制备：种子罐的作用：使有限数量的孢子(菌体)发芽、生长、并繁殖成大量的菌丝体(菌体)，满足发酵罐的需要（菌体生长和产物形成）。
实验室种子进入种子罐有孢子进罐法和摇瓶菌种进罐法。
种子罐级数的确定：种子罐级数是指制备种子逐级扩培的次数。
依据：菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖的速度以及所用的发酵罐的容积。
种子罐(seeding tank)的级数产物的品种生产规模工艺条件种子罐级数越少越好，原因：简化生产工艺和控制减少接种带来的染菌机会需考虑：尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生产而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率［产物／ml·h］。
e.g.谷氨酸发酵一级种子扩培实验室种子种子罐发酵罐e.g. 青霉素二级种子扩培实验室种子一级种子罐二级种子罐发酵罐e.g.链霉素发酵三级种子扩培实验室种子一级种子罐二级种子罐三级种子罐发酵罐三、种龄与接种量1、种龄：指种子罐培养种子从开始至结束的培养时间。
在种子罐中，培养时间延长－－菌体量增加－－基质消耗及代谢产物积累－－菌体量不再增加－－老化过老：生产能力下降，菌体自溶。
过嫩：前期生长缓慢，发酵周期延长，产物形成时间推迟，甚至造成异常发酵。
适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为适宜。
嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，培养１２小时接种，酶活最高。
2、接种量：指移入的种子的体积和接种后培养液的体积比。
抗生素：7%~7.5%谷氨酸：1%接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。
采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物形成提前。
原因：A、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基质的利用B、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。
但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液粘度增加，溶氧降低，产物合成受影响。
e.g. 嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶接种1%，酶活最高；1.5%-4%影响不大；大于4%，酶产量明显下降。
制霉菌素生产中，1%比10%效果好，0.1%与1%效果相当。
发酵生产的趋势：采取大接种量及丰富培养基。
如谷氨酸：大接种量20% ，高生物素，高青霉素的强制发酵工艺。
有的采用双种法增大接种量：两只种子罐一只发酵罐如卡那霉素：双种比单种的发酵单位提高8%，到达产量高峰的时间提前。
倒种法：将培养适宜的发酵液倒出适量给另一个发酵罐作为种子。
如链霉素：倒种法比单种法的发酵单位提高12%。
四、影响种子质量的因素1、原材料质量和培养基组成：如四环素、土霉素生产中配制孢子培养基的麸皮、霉菌用的大（小）米、琼脂的牌号的不同、蛋白胨加工原料不同等均影响种子的质量。
原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的不同，如微量元素Mg2+、Ca2+、Ba2+能刺激孢子的形成。
P 含量的多少也影响种子的质量。
氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，加入其他的营养物（麸皮水解液、豆饼水解液、玉米浆），也对种子质量多少有些影响。
一般情况：培养基糖分要少，氮源要多，无机盐所占的比例要大。
种子罐和发酵罐培养基成分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各成分的数量根据目的各自确定。
总之，各成分选择得当，才能发挥菌种的特征，提高产量。
2、通气和搅拌种子罐中培养的种子除保证供给易于利用的营养物质外，应有足够的通气量，保证菌种的代谢正常例如：在青霉素生产菌的制备过程中，通气充足和不足条件下，得到的种子接入发酵罐发酵，二者的发酵单位相差1倍。
搅拌可以提高通气效果，促进微生物的生长，但是过的的搅拌会导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化变性；泡沫过多容易增加染菌的机会；增加发酵过程的能耗。
3、培养条件温度、pH值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影响种子质量。
制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量影响很大。
如土霉素生产菌种龟裂霉菌的孢子，在北方干燥地区孢子斜面长的快，在含少量水分的试管斜面培养基中下部孢子长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地区，斜面孢子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。
一般相对湿度40~45%时孢子数量最多，孢子颜色均匀，质量较好。
培养时间和冷藏时间对种子和孢子形成都有影响。
如土霉素菌种孢子斜面培养四天左右，即于4℃冰箱保存，发现冷藏7-8天菌体自溶，而培养五天以后冷藏，20天未发现自溶。
链霉素生产菌，斜面孢子在6℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低8%。
五、种子质量的控制措施必须保证生产菌种的稳定性适宜的生长环境提供种子培养的适宜环境条件，保证无杂菌侵入1、菌种稳定性的检查少量菌种--无菌生理盐水--递增稀释--平板划线培养。
挑出形态整齐，孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力。
2、适宜的生长环境提供适宜的生长环境有利于微生物的生长繁殖（丰富的培养基、适宜的培养条件等）。
3、无菌检查显微镜观察、种子液进行无菌检验、生化分析。
种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、异常现象及镜检是否有杂菌。
六. 工业微生物培养的类型静置培养法：即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养发酵，也称为嫌气性培养。
例如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等发酸等发酵均属于此类型。
通气培养法：生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，也称为好气性培养。
例如谷氨酸、核苷酸、有机酸和酶制剂等发酵均属此类型。
通气培养方法可分为液体培养与固态培养两大类型，其中每一类型又有表层与深层之分。
用作种子扩大培养方法又可分为：表面培养法、固体培养法、液体深层培养法、载体培养及两步法液体深层培养。
1 、表面培养法好氧静置培养法。
针对容器内培养基物形态又分为液态表面培养和固体表面培养。
相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养基内传递。
