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生物化学简明教程（第四版)课后习题————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期:２蛋白质化学１.用于测定蛋白质多肽链N端、C端的常用方法有哪些？基本原理是什么？解答:（1) N-末端测定法:常采用2,4―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。
①2,4―二硝基氟苯(DNＦＢ或FＤNB)法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与2,4―二硝基氟苯(2,4―DNFB）反应(Sａngeｒ反应)，生成ＤNP―多肽或DNＰ―蛋白质。
由于ＤNＦB与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP―多肽经酸水解后,只有N―末端氨基酸为黄色DNＰ―氨基酸衍生物,其余的都是游离氨基酸。
②丹磺酰氯(DNS)法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与与丹磺酰氯（DNS―Ｃl)反应生成DＮＳ―多肽或DNS―蛋白质。
由于DＮS与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定,因此DNS―多肽经酸水解后,只有N―末端氨基酸为强烈的荧光物质ＤNＳ―氨基酸，其余的都是游离氨基酸。
③苯异硫氰酸脂(ＰITＣ或Edman降解)法:多肽或蛋白质的游离末端氨基与异硫氰酸苯酯(PITＣ）反应(Eｄman反应),生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质。
在酸性有机溶剂中加热时，N―末端的PTC―氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来,除去N―末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。
④氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，能从多肽链的N端逐个地向里切。
根据不同的反应时间测出酶水解释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N端残基序列。
（2)Ｃ―末端测定法：常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。
肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C端氨基酸以游离形式存在外,其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
②还原法:肽链C端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的α―氨基醇。
2 蛋白质化学 1．用于测定蛋白质多肽链N端、C端的常用方法有哪些？基本原理是什么？解答：（1） N-末端测定法：常采用―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。
① ―二硝基氟苯(DNFB或FDNB法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与―二硝基氟苯（―DNFB）反应（Sanger反应），生成DNP―多肽或DNP―蛋白质。
由于DNFB与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP―多肽经酸水解后，只有N―末端氨基酸为黄色DNP―氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。
②丹磺酰氯(DNS法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与与丹磺酰氯（DNS―Cl）反应生成DNS―多肽或DNS―蛋白质。
由于DNS与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNS―多肽经酸水解后，只有N―末端氨基酸为强烈的荧光物质DNS―氨基酸，其余的都是游离氨基酸。
③苯异硫氰酸脂（PITC或Edman降解）法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与异硫氰酸苯酯（PITC）反应（Edman反应），生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质。
在酸性有机溶剂中加热时，N―末端的PTC―氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N―末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。
④氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，能从多肽链的N端逐个地向里切。
根据不同的反应时间测出酶水解释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N端残基序列。
（2）C―末端测定法：常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。
肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
②还原法：肽链C端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的α―氨基醇。
肽链完全水解后，代表原来C―末端氨基酸的α―氨基醇，可用层析法加以鉴别。
③羧肽酶法：是一类肽链外切酶，专一的从肽链的C―末端开始逐个降解，释放出游离的氨基酸。
被释放的氨基酸数目与种类随反应时间的而变化。
2 蛋白质化学1．用于测定蛋白质多肽链N 端、C 端的常用方法有哪些？基本原理是什么？ 解答：（1） N -末端测定法：常采用―二硝基氟苯法、Edman 降解法、丹磺酰氯法。
①―二硝基氟苯(DNFB 或FDNB)法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与―二硝基氟苯（―DNFB ）反应（Sanger 反应），生成DNP ―多肽或DNP ―蛋白质。
由于DNFB 与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP ―多肽经酸水解后，只有N ―末端氨基酸为黄色DNP ―氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。
② 丹磺酰氯(DNS)法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与与丹磺酰氯（DNS ―Cl ）反应生成DNS ―多肽或DNS ―蛋白质。
由于DNS 与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNS ―多肽经酸水解后，只有N ―末端氨基酸为强烈的荧光物质DNS ―氨基酸，其余的都是游离氨基酸。
③ 苯异硫氰酸脂（PITC 或Edman 降解）法：多肽或蛋白质的游离末端氨基与异硫氰酸苯酯（PITC ）反应（Edman 反应），生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质。
在酸性有机溶剂中加热时，N ―末端的PTC ―氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N ―末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。
④ 氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，能从多肽链的N 端逐个地向里切。
根据不同的反应时间测出酶水解释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N 端残基序列。
（2）C ―末端测定法：常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。
肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C 端氨基酸以游离形式存 在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
② 还原法：肽链C 端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的α―氨基醇。
肽链完全水解后，代表原来C ―末端氨基酸的α―氨基醇，可用层析法加以鉴别。
③ 羧肽酶法：是一类肽链外切酶，专一的从肽链的C ―末端开始逐个降解，释放出游离的氨基酸。
生物化学简明教程
第一章蛋白质化学（于洺）第一节蛋白质通论
第二节氨基酸
第三节蛋白质结构
第四节蛋白质结构与功能
第五节蛋白质性质
第六节分离方法与测定
第二章酶化学（于洺）
第一节酶的分类和命名
第二节酶结构基础和催化策略
第三节酶促反应的动力学
第四节重要的酶类
第五节酶的分离纯化和活力测定
第三章维生素化学（王翔）第一节维生素的分类和命名
第二节重要的脂溶性维生素
第三节重要的水溶性维生素
第四章激素化学（王翔）
第一节激素概念和分类
第二节重要动物激素
第三节激素调控体系
第四节激素的作用原理和细胞信号传递
第五章糖与糖代谢（王翔）
第一节代谢通论和研究方法
第二节糖化学
第三节糖的分解代谢
第四节糖的合成代谢
第五节糖代谢调节
第六节生物氧化
第六章核酸化学（王翔）
第一节DNA结构
第二节核酸变性、复性和杂交
第三节限制性内切酶和DNA测序
第四节染色体结构
第七章DNA的复制、修复
第一节
第八章RNA转录、剪接和修饰第九章蛋白质的合成、修饰附录：生物化学实验（于洺）。
生物化学简明教程（第四版）第2章蛋白质1.蛋白质：是由许多不同的α-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象和一定生物功能的生物大分子。
2.蛋白质的生物学作用：蛋白质是生物体的重要组成成分；蛋白质具有重要的生物学功能：1）作为生物催化剂（酶）2）物质的转运和储存3）运动与支持作用4）免疫保护作用5）代谢调节作用6）参与细胞间信息传递氧化供能3.蛋白质是生物体的重要组成成分：分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。
含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。
4.蛋白质的元素组成：C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、N（15~18%）、S（0~4%）、…Others: P、Cu、Fe、Zn、Mn、Se、I等。
5.每1g蛋白质中的氮相当于6.25g蛋白质。
6.凯氏（Kjeldahl）定氮法：蛋白质含量=（总氮含量-无机氮含量）×6.25。
❤总结：从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：(1)与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，因而称为α-氨基酸(2)除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的α-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性，[左旋（-）或右旋（+）]B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。
目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。
2.1 蛋白质的分类2.1.1根据分子形状分类1）球状蛋白质：（globular protein）外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。
颗星使多种多样的生物学功能。
2）纤维状蛋白质(fibrous protein)分子构象类似纤维或细棒。
它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。
大多数不溶于水。
3）膜蛋白质：一般折叠成近球形，插入生物膜。
2.1.2根据分子组成分类1.简单蛋白(simple protein) ：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由α-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。
（仅由肽链组成，不含有其他辅助成分的蛋白质。
）（1）清蛋白和球蛋白：（albumin and globulin）广泛存在于动物组织中。
清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。
（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70－80％乙醇中。
（3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。
（4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。
2.结合蛋白(conjugated protein)：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，其辅助成分通常称为辅基。
（1）核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。
如细胞核中的核糖核蛋白等。
（2）糖蛋白与蛋白聚糖：由简单蛋白与糖类物质组成。
如细胞膜中的糖蛋白等。
糖与蛋白质的结合方式：O连接和N连接（3）脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。
--脂蛋白等。
（4）色蛋白：由简单蛋白与色素结合而成。
如血红素、过氧化氢酶、细胞色素c等。
（5）磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。
如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。
2.1.3根据功能分类酶调节蛋白贮存蛋白转运蛋白质运动蛋白防御蛋白和毒蛋白受体蛋白支架蛋白结构蛋白异常功能2.2蛋白质的组成单位——氨基酸氨基酸 （amino acid) 是蛋白质的基本组成单位。
从细菌到人类，所有蛋白质都由20种标准氨基酸组成。
2.2.1氨基酸的结构通式2.2.2氨基酸的分类 1.根据R 基的化学结构，可将氨基酸分为①脂肪族氨基酸（疏水性：Gly 、Ala 、Val 、Leu 、Ile 、Met 、Cys ；极性：Arg 、Lys 、Asp 、Glu 、Asn 、Gln 、Ser 、Thr ）②芳香族氨基酸：Phe 、Tyr③杂环氨基酸：Trp 、His④杂环亚氨基酸：ProCOOH C H H 2NR2.按照R基的极性：①非极性R基氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp②不带电荷的极性R基氨基酸：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys③极性带负电荷的R基氨基酸：Asp、Glu④极性带正电荷的R基氨基酸：His、Lys、Arg3.20种常见氨基酸的名称和结构式（见教材P22-24）4.20种标准氨基酸❤总结：①属于芳香族氨基酸的是：色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe②属于亚氨基酸的是：脯氨酸Pro③含硫氨基酸包括：半胱氨酸Cys、甲硫氨酸Met④分子量最小的氨基酸是:甘氨酸Gly⑤能形成二硫键的氨基酸是:半胱氨酸Cys⑥含二羧基一氨基的氨基酸有：谷氨酸Glu、天冬氨酸Asp2.2.3氨基酸的理化性质◆一般物理性质：1.①氨基酸一般有味（无味、甜、苦、鲜等）；②一般均溶于水，溶于酸、碱中；不溶于有机溶剂。
③高熔点（200℃以上）2.氨基酸的旋光性及立体异构：除甘氨酸外，氨基酸含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]，比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。
3.氨基酸的光吸收：①构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。
②在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。
③酪max＝275nm，苯丙氨酸的max＝257nm max ＝280nm。
4.两性电离和等电点：氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在，所谓两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的—NH3+正离子和能接受质子的—COO-负离子，因此氨基酸为两性电解质。
5.等电点：调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—NH3+基和—COO-基的解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。
（当氨基酸相互连接成蛋白质时，只有其侧链基团和末端的α-氨基，α-羧基是可以离子化的。
）6.移动定义：在电场中，不向任何一极移动。
（此时溶液的PH也叫做氨基酸的等电点。
）7.氨基酸等电点的确定：①酸碱滴定（滴定曲线）②根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算：等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。
pI=221PKPK+或者 pI=232PKPK+❤注意：对多氨基和多羧基氨基酸的解离原则：❤结论：①中性氨基酸：pK1为α—羧基的解离常数，pK2为α—氨基的解离常数。
pI=(pK1+pK2)/2②酸性氨基酸：pK1为α—羧基的解离常数，pK2为侧链羧基的解离常数。
pI=(pK1+pK2)/2③碱性氨基酸：pK2为α—氨基的解离常数，pK3为侧链氨基的解离常数。
pI=(pK2+pK3)/28.等电点的应用：pH>pI，aa“-”，aa向正极移动pH<pI，aa“+”，aa向负极移动pH=pI，aa“0”，aa不移动溶液的pH偏离pI越远，氨基酸带净电荷越多，在电场中越容易分离。
利用不同的氨基酸在同一pH下所带电荷不同而分离，如用阴离子交换树脂柱层析分离氨基酸。
等电点时,氨基酸溶解度最小，容易聚集沉淀。
◆化学性质：1.与茚三酮的反应：①氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。
水合茚三酮变为还原型茚三酮。
②加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。
水合茚三酮变为还原型茚三酮。
③NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。
◎脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。
◎反应要点与应用：A.该反应由-NH2与-COOH共同参与B.茚三酮是强氧化剂C.用于氨基酸的定性、定量分析D.该反应非常灵敏，可在λ＝570nm测定吸光值E.测定范围：0.5~50µg/ml F.脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）2.与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法A.为α- NH2的反应B.在常温，中性条件，甲醛与α- NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。
◎应用：①氨基酸定量分析---氨基酸的甲醛滴定法（间接滴定）A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。
B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。
C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）②简单快速，一般用于测定蛋白质的水解或合成的速度..3.与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应：A.为α- NH2的反应B.氨基酸α- NH2的一个H原子，在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成黄色的2,4—二硝基苯基氨基酸（DNP—氨基酸，稳定）◎应用：①鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸②此反应首先由Sanger应用测定蛋白质中氨基酸的排序，确定了胰岛素的一级结构③5—二甲氨基萘磺酰氯（DNS—Cl，又称丹磺酰氯）可以代替DNFB 试剂测定蛋白质的N端氨基酸，灵敏度高。
4.与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应：重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”在弱碱性条件下，氨基酸中的α—氨基与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC—氨基酸）◎反应特点及应用：①为α- NH2的反应②由Edman于1950年首先提出用于N末端分析，又称Edman降解法,此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。
5.与亚硝酸的反应：在标准条件下测定生成氮气的体积，可计算氨基酸的量，称为范斯莱克法。
6.与荧光胺的反应：①氨基酸与荧光胺反应生成具有荧光的产物，是α- NH2的反应②用于氨基酸定量分析③根据荧光强度测定氨基酸含量（ng级）③激发波长λx=390nm，发射波长λm=475nm。
灵敏度高。
7.与5,5′-双硫基-双（2-)硝基苯甲酸反应：-SH的反应,测定样品中游离- SH的含量2.3 肽2.3.1肽的结构1.一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物称为肽。
氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）2.多肽（链）：多个氨基酸残基之间以肽键连接起来的链状化合物叫多肽或多肽链。
3.氨基酸残基：肽链中的每个氨基酸单位在形成肽链时，释放一分子水，因此被称为一个氨基酸“残基”。
4.多肽链有方向性：N 末端：多肽链中有自由氨基的一端；C 末端：多肽链中有自由羧基的一端。
书写时规定将N端放在左边，C端放在右边；命名时，从N端开始，除C端氨基酸外其他氨基酸残基的名称均将“酸”改为“酰”。
5.肽键的特点：肽键平面——由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。
