食品分析湖北大学第八章蛋白质和氨基酸的测定(精)PPT课件

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演示文稿第八章蛋白质和氨基酸的测定(优秀文档)PPT

应用
• 简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于许多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故还没有广泛应用于食品体系。
• 已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量，但此法更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提在碱液或变性剂（如8M尿素）中的蛋白质测定。尽管蛋白质中的肽键在190nm~220nm处的紫外吸收比在280nm更强，但在低紫外区域的测定更困难。
• 灵敏
• 准确
• 快速
• 样品用量少
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三、微量凯氏定氮法
• 原理及适用范围同常量凯氏定氮法 • 主要仪器：凯氏烧瓶（100mL）；微量凯氏
定氮仪 • 试剂：0.01000mol/L HCl 标准液，其余同常
量法 • Page 160
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蛋白质的快速测定－双缩脲法
装置
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操作步骤
消化
准确称取固体样品0.2～2g（半固体样品2～5g，液体样品10～20ml）→移入凯氏烧瓶→加入研细的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml→摇匀→安装消化装置→于凯氏瓶口放一漏斗→以45°角斜支于有小孔的石棉网上→用电炉先以小火加热至内容物全部炭化，泡沫停止后→加大火力保持瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明→继续加热微沸30分钟→冷却→ 定容。加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。
• 因为福林酚法简单、灵敏，已被广泛应用于蛋白质的生物化学中。然而，一般不用于测定未从食品混合物中纯化的蛋白质。
1．非常灵敏： A:较双缩脲法灵敏50~100倍。
B：较280nm紫外吸收法灵敏10~20倍。 C：较茚三酮法灵敏好几倍。 D：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。 2．测定结果较少受到样品混浊度的影响。 3．特异性要高于其他大多数方法。 4．操作相对简单，可以在1~1.5小时内完成。

食品中蛋白质和氨基酸的测定(精)

苋菜红胭脂红柠檬黄日落黄靛蓝亮蓝
2．合成色素的提取
聚酰胺吸附色素
3．定性分析 14．定量分析 5 ．薄层层析法、高效液相色谱法测定的基本要求
三、甜味剂的测定
糖精钠的测定：糖精是应用较为广泛的人工甜味剂其学名为邻—磺酰苯甲酰亚胺其结构式为：
1．HPLC法 2．酚磺酞比色法 [原理] 样品中的糖精钠在酸性条件下用乙醚提取分离后，与酚和硫酸在175 ℃作用，生成酚磺酞，再与氢氧化钠反应产生红色溶液，与标准系列比较定量。 [说明] ①本法受温度影响较大，要使糖精充分与酚在硫酸作用下生成酚磺酞，应严格控制在 175士2℃温度下反应 2小时。②苯甲酸等有机物对测定有干扰，故要通过碱性氧化铝层析柱以排除干扰。 3．紫外分光光度法
二、蛋白质和氨基酸的分类
三、蛋白质的一般性质
1．物理性质
2 ．化学性质
第二节蛋白质的测定
蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法：凯氏定氮法是最常用的，国内外应用普遍；双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法；国外：红外分析仪
④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 ⑤ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继续加热消化。 ⑥ 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 m1的比例增加硫酸用量。
[步骤] 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 1.消化总反应式： 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4= （NH42SO4+6CO2+12SO2+16H2O

8蛋白质和氨基酸的测定.ppt

1、硫酸铜 (CuSO4·5H2O)。 2、硫酸钾。 3、硫酸 (密度为1.8419g/L)。 4、硼酸溶液 (20g/L)。 5、氢氧化钠溶液 (400g/L)。 6、盐酸标准滴定溶液[c(HCl)=0.0500mol/L] 或
硫酸标准滴定溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L] 。 7、混合指示液：1份甲基红乙醇溶液 (1g/L) 与5份溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L) 临用时混合。
分子量 36.5 63.02 100.5 98.0 98.1
含量/(%)(质量分数) 36～38 65～68 70 85 96～98
相对密度 1.18(约)
1.4 1.67 1.70 1.84(约)
浓度/(mol/L) 12(HCl) 16(HNO3)
12(HClO4) 15(H3PO4) 18(H2SO4)
3.难点
1、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。 2、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
§8-1 概述
蛋白质是食品的重要组成成分，蛋白质一
词，在希腊文中是“第一重要”的意思，也就所谓蛋白质是生命的基础。食品的营养价值的
赖氨酸
高低，主要看蛋白质的高低。除了保证食品的天冬氨酸
营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构
四、仪器（GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》第一法）
改良式定氮蒸馏器
半微量定氮蒸馏器
§8-2 食品中蛋白质测定—凯氏定氮法
四、仪器（GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》第一法）
§8-2 食品中蛋白质测定—凯氏定氮法
五、试剂（GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》第一法）
O

第八章蛋白质和氨基酸的测定-第一节概述.ppt

第八章蛋白质和氨基酸的测定 (p114)
第一节概述
蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、 S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。
蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。动物蛋白和豆类蛋白是优良的蛋白质资源。
① 用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。
② 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定。
2020-12-1
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（1）样品消化：总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 ＝NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%），浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化
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2、仪器此法可用于各类食品中蛋白质含量测定，是国家标准方法（GB/T5009.5-1985）。
3、试剂 4、操作方法取样：固体样品0.2-2g，半固态样2-5g，液体样品10-20ml。消化剂：硫酸铜0.5g，硫酸钾10g，浓硫酸20ml。消化结束：液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。蒸馏：以奈氏试剂检查，如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。以奈氏试剂〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕检验NH4+离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕
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（二）脂蛋白的显色：
1、苏丹黑显色法：将0.1g苏丹黑B溶解于煮沸的100ml60％的乙醇溶液中，制备成饱

蛋白质和氨基酸的测定课件

蛋白质和氨基酸的测定
第一页，共68页。
（一）蛋白质组成与分类
1 . 组成Composition
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶体分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主要组成元素是C 、H、O、N、S、P。另外还有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的蛋白质的元素组成百分比。
2H2SO4 +C＝CO2+2SO2+2H2O
二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列物质：
第十四页，共68页。
<1>加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点而加快有机物分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾（1689 ℃ ）之后可以提高至400℃以上。原因主要在于随着消化过程中硫酸不断的被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高，其反应式如下：
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定
⑴ 消化总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 ＝（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
一定要用浓硫酸（98%），浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。
浓硫酸又有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫：
1.含量由于食品种类很多，所以蛋白质含量分布是不均匀的，一般动物组织蛋白质含量高于植物组织，而且动物组织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物是以种子含量高，豆类含蛋白质最高。

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食品中的蛋白质测定
• 原理、过程及试剂消化——蒸馏与吸收——滴定消化----浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾蒸馏----氢氧化钠吸收----硼酸滴定----盐酸、混合指示剂
消化
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%）
紫外分光光度法、染料结合法、水杨酸比色法等。下面简单介绍双缩脲法
1. 原理脲（尿素）缩和成双缩脲。
NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2
NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3
双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）
蒸馏与吸收
热消
蒸化
馏液
+%
，
放出
40
氨氢
气氧。化
钠
加
滴定
. .
然滴用后定盐进至酸行终标计点准算溶
液
微量凯氏定氮装置
蛋白质测定仪------消化、蒸馏吸收
蛋白质测定仪---滴定
KDN型蛋白质测定仪
•
QSY-Ⅱ型蛋白质测定仪
•
3 .蛋白质的快速测定法
传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。新开发的：双缩脲法、
5. 氨基酸的分离与测定
（一）薄层色谱法（二）氨基酸自动分析仪法（三）气相色谱法（四）高效液相色谱法
（一）薄层色谱法
• 原理：取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄
层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。
方法特点及应用范围
• 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。
4. 氨基酸总量的测定
• （一）甲醛滴定法 • （二）茚三酮的比色法
（一）甲醛滴定法
1.原理：氨基酸本身有碱性 —NH2— 基，又有酸性 —COOH 基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，甲醛与 —NH2— 结合，碱性消失，再用强碱来滴定 —COOH 基。
• Rf = a / b b
溶剂前沿样点
a
点样原点
操作方法： ① 薄层板制备 ② 样品液制备 ③ 点样 ④ 展开 ⑤ 显色
（二）氨基酸自动分析仪法
（三）气相色谱法
（四）高效液相色谱法
• 本章小结 1、重、难点及适用范围凯氏定氮法测定蛋白质的过程及注意事项 2、了解仪器法测定蛋白质及氨基酸的方法 3、下次课做实验----实验要求 4、作业
• 2．适用范围：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况及食品中游离氨基酸的测定等。
3．试剂：
① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。
② 0.1%百里酚酞乙醇溶液，
③ 0.1%中性红50%乙醇溶液，
④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。
4．操作：同时取两份样：
一份中加中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性物质。
另一份中加百里酚酞、中性甲醛用NaOH 滴，中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。二者之差可计算氨基酸含量
（二）茚三酮的比色法
• 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。
蛋白质测定
• 学习目标 • 1.了解蛋白质的性质 • 2.明确蛋白质测定方法 • 2.掌握凯氏定氮法测定蛋白质的过程及注
意事项 • 3.了解氨基酸的性质和测定方法
蛋白质和氨基酸测定内容
1. 概述 2. 凯氏定氮法 3 .蛋白质的快速测定法 4. 氨基酸总量的测定 5. 氨基酸的分离与测定
1. 概述
(1)蛋白质的生理功用及在食品中的作用（2）食品中的蛋白质含量（3）蛋白质系数（4）蛋白质水解（5）蛋白质测定方法
(6)氨基酸的测定与分离方法
2. 凯氏定氮法
原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。
提问与解答环节
Questions And Answers
谢谢聆听
·学习就是为了达到一定目的而努力去干, 是为一个目标去战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折
Learning Is To Achieve A Certain Goal And Work Hard, Is A Process To Overcome Various Difficulties For A Goal