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ELISA法HBsAg检测的注意要点室内质控（IQC）是由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本室常规工作的重复性和精密度，提高本室常规工作中样本检验的一致性，保证每个患者样本验测结果的稳定性。
临床实验室常规HBsAg检验步骤很多，基本上可分为标本收集、实验室测定过程和结果报告及其解释等；规范化的、认真细致的测定过程可以杜绝过失误差，减少随机误差，及时发现系统误差，在室内质控中起着决定性作用。
现将我科HBsAg检测过程中的注意要点报道如下：1 材料与方法1.1主要试剂及设备上海科华生物技术有限公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（批号20081217），省临验中心分发的HBSAg室内质控品（正常浓度批号为090040，病理浓度批号为090041），上海安泰生产酶标仪（AT－858）和洗板机（AT－828）。
1.2方法采用单克隆抗－HBS包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗－HBS－HRP，当标本中存在HBSAg时该HBsAg与包被抗－HBS结合并与抗－HBS－HRP结合形成抗－HBS－HBsAg－抗－HBS－HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
2规范化操作及注意要点2.1从冷藏柜中取出的试剂、质控品及待测标本均需室温平衡30分钟。
2.2待测标本、阴阳性对照及质控品应沿反应孔壁加入，不可有气泡。
2.3酶结合物、显色剂、终止液使用前应摇匀，并弃去1￣2滴垂直滴入。
2.4孵育的时间和温度应严格按试剂盒说明书操作。
2.5注意洗涤液不要溢出，防止污染它孔。
2.6洗板机选择洗涤5次程序，洗板后注意拍干。
2.7酶标仪读数时使用双波长（450nm和630nm），先用空白孔校零。
2.8封片不可重复使用。
2.9结果判断须在反应终止后10分钟内完成。
二个不同浓度的质控品随正常工作日患者样本一道，按试剂盒说明书同时检测。
3结果判断样品OD值/阴性对照平均OD值≥2.1为阳性，否则为阴性。
对ELISA方法检测HBSAg结果的分析当前国内临床检测乙型肝炎表面抗原(HBSAg)多采用ELISA双抗体夹心法，其基本原理是:1.将抗体包被在载体后作为固相，加入待测标本，使其中的相应抗原通过免疫学反应结合到固相抗体上，洗涤除去未结合的抗原。
2.加入酶结合物与已结合在固相抗体上的抗原反应，并洗涤除去未结合的游离未结合物。
3.加入酶（常用辣根过氧化物酶）的相应底物，固相化的酶催化底物反应生成有色产物。
在一定温度下一定时间后终止反应，显色物的量与在固相上的抗原有关。
该方法检测HBSAg时，影响的因素很多，有内源性物质和外源性物质两大类。
血清是最常见的ELISA标本，大约有40%的人血清标本中含有类风湿因子，补体，嗜异性抗体，嗜靶抗原自身抗体等非特异性物质，对ELISA测定有干扰作用易造成假阳性或假阴性结果，这不是人为因素造成的。
在临床检验工作中，常因标本量多，紧急要求出检验报告，较难逐个分析其内源性的物质，而忽略它的存在。
而工作中，因血样的采集，储存及操作程序等不当所致的外源性物质的干扰，最易影响ELISA的测定结果。
本文对检验工作中经常出现的如标本溶血，标本被细菌污染，标本储存过久，标本凝固不全等因素进行分析。
1.标本溶血由于各种人为因素引起标本溶血，使红细胞溶解细胞内的过氧化物酶进入血浆，并大量吸附于细胞碎片及纤维蛋白原上,从而造成以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，非特异性显色，出现假阳性。
有试验证明溶血标本HBSAg假阳性率达91.7%[1]。
要认真做好标本的保存和处理工作，防止溶血。
2.标本受到污染标本受细菌污染，因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶同样易产生非特异性显色，出现假阳性。
3.标本放置时间在冰箱中保存过久的标本，血清中IGg可聚合成多聚体，AFP可形成二聚体，在ELISA测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。
采血后若不在当天检测，应置于2-8℃冰箱中，若要储存，则置于-20℃低温冰箱内保存。
ELISA法和胶体金免疫层析法检测乙肝表面抗原结果分析目的：分别采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和胶体金免疫层析（GICA）法检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg），对比结果，探讨两种方法检测乙肝表面抗原的应用价值。
方法：分别采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和胶体金免疫层析（GICA）法检测768份18～65岁人群血清标本，对比乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）检测结果。
结果：胶体金免疫层析法检测出HBsAg阳性标本42份，阳性率5.47%。
ELISA法检测出HBsAg阳性标本46份，阳性率为5.98%，两种方法阳性检出率差异无统计学意义（P>0.05）。
两种方法检测的符合率为97.39%。
胶体金免疫层析法的灵敏度为69.57%，特异度为98.61%。
结论：胶体金免疫层析法操作简便、快速，检测的特异度较高，但其灵敏度有限，有待提高。
标签：酶联免疫吸附试验法；胶体金免疫层析法；乙肝表面抗原乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后所引起的疾病，是当前严重危害人类身体健康的传染病。
乙型病毒肝炎表面抗原（HBsAg）阳性是感染乙肝病毒的重要指标。
酶联免疫吸附试验（ELISA）法是目前我国检测乙肝HBsAg最为普及的方法，应用时间较早，而胶体金免疫层析法是近年来采用的免疫学检测方法。
本组研究资料采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和胶体金免疫层析（GICA）法对768份18～65岁人群血清进行HBsAg检测，并对比检测结果。
现报告如下：1材料与方法1.1标本来源抽取18～65岁人群血清768份，采集无溶血、无脂浊的静脉血标本3～5ml，室温静置30min后，4000r∕min离心5min，充分分离血清待检。
1.2仪器与试剂乙肝五项胶体金快速检测板由上海科华生物科技有限公司提供，HBsAg试纸条由蓝十字生物药业有限公司提供；ELISA检测试剂由珠海丽珠生物科技有限公司公司提供；TDL-42A低速离心机；Unto-FLiudo全自动酶标洗板机；Unto-2010酶标仪。
利用ELISA法检测乙肝五项操作过程中的几点注意事项【中图分类号】R512.6+2 【文献标识码】B 【文章编号】1672-5085(2009)13-0236-02目前，临床乙肝五项检测一般采用ELISA法，因为ELISA法是当前灵敏度较高，特异性较好的方法，被临床广泛认可，而且操作非常简单。
但在操作过程中各个环节对检测结果影响较大。
望广大检验工作者引起高度重视，要严格遵守操作规程。
一般涉及标本的采集和保存、试剂的选择和准备、加样、浴温、冲板、显色、比色各步骤。
下面将操作过程中各个环节的注意事项做以下简介：1 标本的采集及保存采血管，优点是既可以预防血液中的气溶胶粒子在空气中传播，对工作人员造成危害，又可以防止标本被污染。
采血过程一定按无菌操作，保证采血顺畅,不要进行剧烈震荡，避免产生溶血现象，因溶血标本或长菌标本会造成假阳性结果。
血液标本采集后要使其充分凝固再分离血清，最好放置1小时，然后再用3000rmp离心15分钟，若当天检测可以放在室温，如果在次日或几天内检测，可分离血清后，放在2-8℃冰箱内保存，用时提前取出，恢复至室温温度时方可检测，如果长时间保存，必须分离血清后置于-20℃低温冰箱内密封保存，用时先置于2-8℃冰箱中使之溶解，然后在室温下使之全溶，方可使用。
2 试剂的选择及准备选择质量优质的试剂盒，严格阅读使用说明书，操作前将试剂在室温平衡30分钟，目的主要是为了保证试剂及反应微孔在后面浴温过程中能够较快达到所要求的温度，稀释洗板液所用蒸馏水或去离子水一定要保证质量，而且要当天用当天配制。
3 加入样本及反应试剂血清或血浆标本一定要分离好，决不能将纤维蛋白原或血球带入反应微孔中，避免出现假阳性或假阴性。
加样器必须经过校准；加样速度不可以太快，加样太快无法保证微量加样器的准确性和均一性；避免加在孔壁上部，加在孔壁上部的非包被区易导致非特异性吸附；避免样本溅出或产生气泡，溅出会对邻近孔造成污染，出现气泡则反应液界面有差异。
人乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中乙肝表面抗原（HBsAg）水平。
实验原理：本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）。
用纯化的人乙肝表面抗原（HBsAg）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中乙肝表面抗原（HBsAg）相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的乙肝表面抗原（HBsAg）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）的存在与否。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
ＥＬＩＳＡ法检测血清中ＨＢｓＡｇ的结果不确定度分析目前ELISA法在临床检验中已被广泛应用,具有一定的代表性,而有关ELISA 法检测结果的不确定度评定的应用报道很少。
本文根据JJF1059—1999《测量不确定度评定与表示》[1],通过对典型例子不确定度的分析和量化,建立了ELISA法检测HBsAg结果不确定度的评定程序,通过对检测结果不确定度的评估,对检测结果进行完整地表达,避免或降低了出现假阴性结果的风险。
1 材料与方法1.1 材料试剂为乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法),上海科华生物技术有限公司产品。
设备为Thermo MK3型酶标读数仪。
依据GB15990—1995《乙型病毒性肝炎的诊断标准及处理原则》[2]进行检测。
1.2 方法在板架上放好酶标板条,每孔加入50 μL待测血清或阴、阳性对照,设阴、阳性对照各2孔。
每孔加入酶结合物50 μL,置37℃孵育30 min。
洗板5次后,每孔加显色剂A液、B液各50μL,置37℃孵育15 min。
每孔加入终止液50 μL后,用酶标仪读数,取主波长450 nm,参考波长630 nm读取各孔OD值。
2 结果2.1 被测物数学模型公式:ΔA=S-CO式中:ΔA—结论判定;S—待测血清吸光度值(OD值);CO—临界值(cut-off)=NCx×2.1。
NC—阴性对照OD值;NCx—阴性对照平均OD值;2.1为修正系数。
2.2 结果判定当阴性对照OD均值0.05时以实际OD值计算。
ΔA≥0者为HBsAg阳性,ΔA0.05时以实际OD值计算,见表2。
3 讨论3.1 分析和量化不确定度分量3.1.1 临界值CO的不确定度就是阴性对照平均值(NCx)的不确定度,NCx的不确定度主要由2个分量组成,即:由系统效应引起的阴性对照OD值NC的不确定度和由重复性试验(只有当阴性对照OD值NC大于0.05时)中随机效应rep引起的不确定度。
阴性对照NC代表的是阴性对照在某特定波长下的吸光度值,根据朗伯一比耳定律,吸光度值与吸光系数(a或ε)、液层厚度(b)和阴性样液浓度(C0)成正比,对于某一特定的显色反应来说,吸光系数是个常数。
人乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中乙肝表面抗原（HBsAg）水平。
实验原理：本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）。
用纯化的人乙肝表面抗原（HBsAg）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中乙肝表面抗原（HBsAg）相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的乙肝表面抗原（HBsAg）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）的存在与否。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
乙肝表面抗原的E L I S A法定量分析方法学验证 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证摘要目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。
方法：ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsA g标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，ml 3个浓度梯度5复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。
结果：标准曲线R2=，准确度%，m l的RSD为%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，检测限LOD为ml，低浓度样品（<ml）的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。
结论：该HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不能用于临床标本的分析。
关键词：乙肝表面抗原 ELISA 定量分析方法学验证前言乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。
随着免疫学技术的不断发展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平乙肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义[1]。
ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫分析仪上做批量检测。
目前临床上多倾向于做定量分析，若想知道检验结果是否可靠，实验室则必须对所用试剂盒进行方法学验证，本实验对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的E LISA法定量分析试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现报告如下。
1. 材料与方法试剂盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。
仪器酶标仪：Bio-Rad 680 ；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix ；电热恒温培养箱(DNP-9052)上海精宏实验设备有限公司；振荡器（苏州管械，KJ-201 A）；移液器；Tip头；EP管。
一、实验背景乙型肝炎（Hepatitis B）是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝脏感染疾病，具有高度传染性。
乙型肝炎病毒主要通过血液、性接触和母婴垂直传播。
乙型肝炎病毒感染可分为急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎。
急性乙型肝炎多数病例可自愈，而慢性乙型肝炎则可能导致肝硬化、肝细胞癌等严重后果。
为了了解乙型肝炎病毒的感染情况和病毒复制水平，本实验采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了乙型肝炎病毒五项指标，包括乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）和乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）。
二、实验目的1. 检测乙型肝炎病毒感染情况，判断患者是否为乙型肝炎病毒感染者。
2. 评估病毒复制水平，为临床诊断和治疗提供依据。
三、实验方法1. 标本采集：采集患者血清，置于-20℃冰箱保存。
2. 试剂与仪器：乙型肝炎病毒五项检测试剂盒（ELISA法）、酶标仪、移液器、离心机等。
3. 实验步骤：1. 将试剂取出室温平衡30分钟。
2. 按照试剂盒说明书进行操作，包括加样、孵育、洗涤、显色等步骤。
3. 使用酶标仪检测各孔的吸光度值（OD值）。
4. 根据标准曲线计算各指标的含量。
四、实验结果1. HBsAg阳性，表明患者为乙型肝炎病毒感染者。
2. HBsAb阴性，表明患者未产生保护性抗体。
3. HBeAg阳性，表明病毒复制活跃。
4. HBeAb阴性，表明病毒复制尚未停止。
5. HBcAb阳性，表明患者曾感染或正在感染乙型肝炎病毒。
五、分析与讨论1. 本实验结果显示，患者为乙型肝炎病毒感染者，病毒复制活跃，可能存在慢性乙型肝炎的风险。
2. 患者未产生保护性抗体，建议接种乙型肝炎疫苗，以提高免疫力。
3. 患者HBcAb阳性，表明曾感染或正在感染乙型肝炎病毒，需进一步检查肝功能，以评估肝脏损伤程度。
六、结论本实验采用ELISA法检测了乙型肝炎病毒五项指标，结果表明患者为乙型肝炎病毒感染者，病毒复制活跃。
