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抗体制备及效价测定讲义实验一、兔抗人IgG制备一、实验材料1．实验动物：健康雄性家兔1只；2．抗原：纯化人IgG lmg；3．实验试剂：完全福氏佐剂（CFA），不完全弗氏佐剂（IFA），0.01M PBS（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以NaOH调节pH至7.2，加双蒸水至1000 mL），普鲁卡因溶液，肾上腺素，硫柳汞，叠氮钠。
4．实验用具：2.5mL、5mL注射器，10mL无菌小烧杯，塑料静脉插管，5mL无菌冻存管，250mL 无菌三角瓶，50mL无菌尖底离心管。
二、操作步骤1．抗原制备：将纯化的人IgG用0.01M PBS（pH7.2）或生理盐水稀释成lmg/mL，加入等体积无菌CFA或IFA 至5mL无菌冻存管中，置于超声波破碎仪上，粉碎头浸入液面下0.5-0.8 cm，离瓶底距离0.5 cm左右，以免打碎玻璃瓶，抗原置冰上，每次乳化10-15秒，间隔1分钟左右，反复乳化3-4次即。
将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。
2．家兔免疫：（1）家兔捉拿方法：一只手抓住兔的颈部皮毛，将兔提起，用另一只手托其臀，或用手抓住背部皮肤提起来，放在实验台上，如图1：图1 家兔的捉拿方法（2）初次免疫：在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处选择6-10处免疫接种点，采用肌内、皮下或皮内注射，每点注射上述乳化人IgG抗原0.2mL。
（3）二次免疫：第一次免疫后间隔2周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。
（4）三次免疫：第二次免疫后间隔1周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。
（5）终末免疫：第三次免疫后间隔1周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。
疫苗效价测定方法疫苗效价测定是评估疫苗质量和有效性的重要指标之一。
通过准确测定疫苗中的有效成分，可以确定疫苗的效力。
本文将详细介绍疫苗效价测定的方法及其步骤，旨在帮助读者了解和应用这一重要的测定方法。
一、疫苗效价测定方法的基本原理疫苗效价测定是通过实验方法测定疫苗中有效免疫物质的含量，进而评估疫苗的免疫力。
一般来说，疫苗效价的测定主要分为两种方法：生物学方法和化学物理方法。
生物学方法是通过动物实验来评估疫苗效力，如活病毒疫苗的TCID50法、灭活疫苗的保护性实验法等。
化学物理方法则是通过测定特定成分的含量来评估疫苗效力，如疫苗抗原含量的酶标法、蛋白质含量的比色法等。
1. 建立实验流程：首先，需要确定实验目的和所需测定的疫苗成分，然后制定实验方案和操作流程，确保实验的可重复性和准确性。
2. 样品制备：样品制备是疫苗效价测定的关键步骤之一。
根据实验方案，选择适当的方法提取和纯化疫苗中的有效成分。
具体方法可以根据疫苗类型和测定对象的不同而有所区别。
3. 样品检测：将制备好的样品进行检测，可以选择合适的化学物理方法或生物学方法进行测定。
比如通过酶标法检测疫苗中的抗原含量，或通过保护性实验评估疫苗的免疫力。
4. 数据处理和分析：根据实验结果，进行数据处理和统计分析，计算出疫苗中有效成分的含量，并评估疫苗的效力。
在此过程中，需要根据实验设计和原理进行相应的计算和判断。
三、疫苗效价测定方法的举例说明以灭活疫苗的抗体测定为例，介绍疫苗效价测定的具体步骤：1. 实验目的：评估灭活疫苗中免疫抗体的含量，以确定疫苗的效力。
2. 实验方案：按照标准操作要求，严格控制所有实验条件，包括实验设备、试剂和动物模型的选取。
3. 样品制备：将灭活疫苗经过特定处理提取出相关免疫抗体。
方法可以采用比色法、酶标法等。
4. 样品检测：选取合适的生物学方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)，进行免疫抗体的定量测定。
5. 数据处理和分析：根据测定结果，计算出免疫抗体的含量，并进行统计分析。
抗体效价检测步骤抗体效价检测是一种用于确定特定抗体在溶液中的浓度的测试方法。
制定抗体检测方案的目的是为了发现一些疾病或病菌感染后体内的抗体水平，以便给这些人提供更好的诊断和治疗方案。
抗体检测可以帮助诊断多种疾病和监测免疫应答。
抗体效价检测的步骤：1. 确定抗原：首先，需要选择与所检测试物一致的合适抗原。
可以是病原体中的某个蛋白质、脂多糖、多糖等化合物。
2. 制备样品：接下来，需要制备出一定浓度的抗原，然后制备一定浓度的粗抗血清作为实验对象，这里抗血清就是被免疫动物或人的血清。
3. 设置不同浓度的样品和抗体：设置一系列不同浓度的测定样品和一定浓度的抗体，一般会先制作含有较多抗体的肯定样品和不含抗体的阴性对照样品。
4. 混合样品和抗体：添加不同浓度的抗体到不同浓度的抗原溶液中或在不同浓度的抗原中加入相同浓度的抗血清，稀释一定倍数（常用2倍）后，把稀释完后的溶液混合均匀。
5. 反应：将混合物加入试剂板中，以促使抗体与抗原结合并发生反应，在一定的条件下，让其反应一定的时间（常用30分钟到数小时）。
6. 洗涤：去掉未结合的物质，洗刷试管或板，这是为了减少误差，使试验结果更加可信。
7. 加入检测酶标记二抗：在试管或板中加入检测酶标记的二抗，这通常是一种抗体，其可与被检测抗体特异性结合。
8. 再次洗涤：去掉未结合的物质，称为第二次洗涤。
9. 加入底物：加入相应的酶底物，以促使反应物下一步的曝光和输送。
10. 停止反应：反应一定时间（通常为10–30分钟），使颜色发生变化，这里会加入用于停止反应的酸或酵素抑制剂。
11. 测定结果：测定反应颜色的浓度，以反映所检知物的含量，从而确定抗体效价，也就是可以得到测量结果，用来确定抗体的水平。
抗体效价检测是一种非常重要的诊断方法，它可以帮助医生和研究人员快速探讨细菌和疾病的数量变化，进而制作出更有效的治疗和疫苗。
抗体效价检测标准
抗体效价检测是测定抗体的物理状态及其在体内的滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果的一种方法。
通常用于诊断和治疗某些免疫相关疾病。
抗体效价检测的具体标准可能因疾病、检测方法和实验室而异，但一般都会遵循以下步骤：
1. 准备试剂：包括抗体样本、抗原、缓冲液、标记物等。
2. 样本处理：将抗体样本进行处理，如稀释、离心等，以去除杂质和干扰因素。
3. 抗原-抗体反应：将抗原与抗体样本混合，在一定温度下反应一定时间，使抗原和抗体充分结合。
4. 洗涤：去除未结合的抗原、抗体和干扰物质。
5. 检测：根据所采用的检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术等，对反应产物进行检测。
6. 结果判断：根据实验结果判断抗体效价是否正常。
通常，效价高于正常值表示抗体水平较高，可能存在免疫相关疾病或感染；效价低于正常值则表示抗体水平较低，可能存在免疫缺陷或疾病进展。
需要注意的是，不同的检测方法和实验室可能有不同的标准范围和操作流程。
因此，在进行抗体效价检测时，应遵循所采用的方法和实验室的标准操作规程。
抗体效价检测步骤抗体效价检测是一种常用的方法，用于评估抗体样品的质量和活性。
该检测可以确定抗体样品中所含抗体的浓度以及其与靶标结合的能力。
以下是抗体效价检测的一般步骤：1. 制备样品和控制组：首先需要准备抗体样品和相应的阳性和阴性对照物。
阳性对照物是对于靶标已知有高亲和力的抗体样品，而阴性对照物则是不包含任何抗体的样品。
2. 稀释样品：将抗体样品进行连续稀释，通常从高浓度开始，以便确定抗体效价的范围。
每一次稀释应按照一定比例进行，如1:2或1:10等。
3. 设置试验板：将稀释好的抗体样品、阳性和阴性对照物，以及含有靶标的试验物添加到试验板中的孔中。
每个样品应设置多个孔，以获得平均效价。
4. 孵育：将试验板置于孵化器中，在适当的温度和时间下进行孵育。
这有助于抗体与靶标结合，并形成固定复合物。
5. 洗脱：将试验板的孔洗脱干净，以去除未结合的抗体。
这可以通过重复洗涤孔中添加和去除缓冲液来实现。
6. 反应：加入检测抗体，这是一种能与固定复合物中的抗原结合的二抗。
检测抗体通常被标记，以便进行可视化。
典型的标记物包括酶，如辣根过氧化物酶（HRP），或荧光染料，如荧光素等。
7. 反应孵育：将试验板放回孵化器中，在合适的温度下进行孵育。
这有助于检测抗体与固定复合物结合，并形成更大的复合物。
8. 洗脱：类似于步骤5，洗涤试验板的孔，以去除未结合的检测抗体。
9. 可视化：根据检测抗体的标记物，对于酶标记的检测抗体可以加入亮色底物，并观察色素的产生。
对于荧光标记的检测抗体，则可以在荧光显微镜下直接观察发光信号。
10. 数据分析：根据样品和对照组的可视化结果，测定抗体效价。
通常使用半最大抗体效价（EC50）来表示抗体效价，即抗体浓度在50%时与靶标结合。
抗体效价检测是一个常见的实验技术，它在抗体研究和生物医学领域有着广泛的应用。
通过正确执行上述步骤，可以准确地确定抗体样品的效价和活性，进一步支持科研和临床应用。
实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。
结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。
①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异。
免疫血清的制备及效价测定制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。
由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。
制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。
因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。
测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。
第一部分、免疫血清的制备我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG抗体的制备。
Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。
可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。
在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。
【实验材料】1．动物IgG（兔源的，购买）2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物： BALB/c小鼠5．无菌 1ml 注射器6. 生理盐水，酒精棉等【实验步骤】1. 免疫程序：40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。
一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。
2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。
第二部分、免疫血清质量评价一、 效价测定抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法—）、琼脂扩散法1.操作步骤（具体见附注）⑴ 做琼脂板，打梅花孔。
抗体效价检测步骤抗体效价检测是一种测定抗体的浓度及活性的方法，通常用于评估抗体的质量和效能。
以下是抗体效价检测的一般步骤，供您参考。
1. 制备样本：首先，从动物体内或培养物中收集抗体样本。
例如，可以从实验动物体内收集抗体样本，或从培养的细胞上清液中收集抗体样本。
确保样本的收集过程在符合生物安全标准的条件下进行。
2. 稀释样本：抗体样本通常会被稀释，以确保在合适的浓度范围内进行测定。
稀释倍数的选择应根据抗体的预计浓度和检测方法的灵敏度来确定。
3. 样本预处理：根据实验的需要，可能需要对样本进行一些处理。
例如，可以对样本进行加热、酶处理或亲和纯化等步骤。
4. 准备控制组：在进行抗体效价检测之前，还需要准备一些控制组。
这些控制组可以包括阴性对照、阳性对照和参考标准，用于确保检测结果的准确性和可靠性。
5. 测定方法选择：根据实验的需要和可用的设备/试剂，选择适合的抗体效价测定方法。
常见的方法包括ELISA、Western blot、免疫组化等，可根据实验目的选择不同的方法。
6. 进行测定：按照选定的方法操作，将稀释的样本和控制组加入适当的载体（如微孔板）中，与相应的检测试剂反应。
通过适当的信号检测方法，如吸光度测定、荧光测定或放射免疫测定等，测量不同样本的信号强度。
7. 数据分析：使用适当的软件或计算方法，对测定结果进行数据分析。
根据标准曲线、控制组和参考标准的结果，计算样本中抗体的浓度或抗体效价。
8. 结果解释：根据测定结果，对抗体样本的浓度或效价进行解释。
可以根据人体抗体效价的标准范围，判断抗体活性和质量的好坏。
9. 结果验证：为了确保结果的准确性，可以进行结果的验证实验。
例如，可以通过再次测定部分样本或使用其他独立的方法进行验证。
以上是抗体效价检测的一般步骤，实际操作中可能会有些差异，具体步骤可能会根据实验目的、检测方法和设备要求等因素进行调整。
在进行抗体效价检测时，一定要严格按照实验操作规程进行，确保结果的准确性和可靠性。
一、实训目的1. 掌握抗体制备的基本原理和方法。
2. 学会使用ELISA、Western blot等实验技术对制备的抗体进行鉴定。
3. 培养实验操作技能和严谨的科学态度。
二、实训原理抗体是机体免疫系统在抗原刺激下产生的具有特异性结合能力的蛋白质。
抗体制备通常采用免疫动物的方法，通过免疫动物产生特异性抗体，再通过细胞融合等技术制备单克隆抗体。
三、实训材料1. 实验动物：Balb/c小鼠。
2. 抗原：人血清白蛋白（HSA）。
3. 细胞：杂交瘤细胞。
4. 试剂：免疫球蛋白、细胞培养试剂、ELISA试剂盒、Western blot试剂等。
5. 仪器：酶标仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统等。
四、实训步骤1. 免疫动物- 将HSA与载体蛋白（如BSA）偶联，制备免疫原。
- 将免疫原免疫Balb/c小鼠，定期采集血清，检测抗体效价。
2. 细胞融合- 将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能分泌抗体的杂交瘤细胞。
- 将杂交瘤细胞进行克隆化培养，得到纯化的杂交瘤细胞。
3. 抗体制备- 将纯化的杂交瘤细胞进行培养，收集细胞培养上清或腹水，提取抗体。
4. 抗体鉴定- ELISA鉴定- 将HSA包被在微孔板上，加入抗体样品，检测抗体与HSA的结合情况。
- Western blot鉴定- 将HSA进行SDS-PAGE电泳，转膜，加入抗体，检测抗体与HSA的结合情况。
五、实训结果1. 免疫动物- 成功免疫Balb/c小鼠，采集到抗体效价较高的血清。
2. 细胞融合- 成功筛选出能分泌抗体的杂交瘤细胞，并进行克隆化培养。
3. 抗体制备- 成功制备抗体，并进行纯化。
4. 抗体鉴定- ELISA鉴定：抗体与HSA结合良好，表明抗体具有特异性。
- Western blot鉴定：抗体与HSA结合良好，表明抗体具有特异性。
六、实训讨论1. 抗体制备过程中，免疫动物的选择、免疫原的制备、细胞融合条件等因素都会影响抗体的制备效果。
2. 抗体鉴定方法包括ELISA、Western blot、ELISPOT等，可根据实验需求选择合适的鉴定方法。
免疫实验—抗血清制备及抗体效价检测摘要：用具有抗原性的物质牛血清白蛋白（BSA)注入到健康动物例如鼠、兔的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
抗血清，是指含有免疫蛋白的血清。
抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。
此次实验主要是进行小鼠的牛血清白蛋白（BSA)抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验（ELISA）对其进行抗体效价检测。
关键字：牛血清白蛋白（BSA) 抗血清抗体效价免疫实验过程：本次实验一共分为三个分实验：实验一：免疫实验二：抽血、放血，分离抗血清实验三：ELISA测定抗体效价实验一：免疫一、抗血清制备的原理用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
二、目的制备高效价的抗血清三、实验仪器、材料和试剂实验仪器：1mL 注射器，酒精棉球，剪刀材料：家兔，小鼠试剂：3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸，牛血清白蛋白（BSA)三、方法和步骤1、动物编号左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。
红色表示十位数,用黄色表示个位数。
免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。
2、动物抓取及注射按如下图所示抓取目标动物家兔为300～600 μg/次（400），每次不超过2mL；小鼠为10～100 μg /次（10-20，20~40 μg / ml），每次不超过0.5mL。
小鼠腹腔注射以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推?0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。
免疫学实验抗血清的制备及其效价测定班级：生物技术1401小组：11姓名：2016年11月抗血清的制备及免疫小鼠效价检测摘要：本试验以牛血清白蛋白为抗原，对小鼠和家兔进行免疫，以制备高效价抗血清。
采用多次中程免疫使产生免疫应答小鼠的血清中抗体达到实验所需的要求，然后采集小鼠血液，从中分离出血清，从而获得抗血清。
利用间接ELISA 方法测得抗血清效价。
关键词：抗血清；间接法ELISA ；抗体效价前言：用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经三次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
酶联免疫吸附实验（ELISA ）是一种新型的免疫测定技术，利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加相应的二抗，生成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。
材料与方法：实验主线：实验材料：包被缓冲液（0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液）、10ug/ml 抗原（牛血清白蛋白）、0.01M PBS 溶液、5%（w/v ）脱脂奶粉、PBST 洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01M 的PBS ）、2M H2SO4、待测抗体、HRP 标记的羊抗小鼠IgG （二抗）、底物溶液TMB 、健康小鼠酶标板、酶标仪、保鲜膜、排枪、离心管、玻璃棒、烧杯、离心机、恒温箱动物免疫抗血清的采集与分离中程免疫3次间隔一周间接法ELISA 测定抗血清的效多克隆抗体实验内容与方法：一．动物的免疫：1.1实验动物的选择选择实验动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。
选择与抗原亲缘关系远的动物，尤其在制备抗免疫球蛋白（Ig）抗体时；根据抗体的需要量选择动物，制备一抗常用动物为小鼠和家兔，制备二抗常用动物为羊和马；常用青壮年期的雄性动物。
免疫学实验报告 Modified by JACK on the afternoon of December 26, 2020免疫实验—抗血清制备及抗体效价检测摘要：用具有抗原性的物质牛血清白蛋白（BSA)注入到健康动物例如鼠、兔的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
抗血清，是指含有免疫蛋白的血清。
抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。
此次实验主要是进行小鼠的牛血清白蛋白（BSA)抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验（ELISA）对其进行抗体效价检测。
关键字：牛血清白蛋白（BSA) 抗血清抗体效价免疫实验过程：本次实验一共分为三个分实验：实验一：免疫实验二：抽血、放血，分离抗血清实验三：ELISA测定抗体效价实验一：免疫一、抗血清制备的原理用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
二、目的制备高效价的抗血清三、实验仪器、材料和试剂实验仪器：1mL 注射器，酒精棉球，剪刀材料：家兔，小鼠试剂：3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸，牛血清白蛋白（BSA)三、方法和步骤1、动物编号左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。
红色表示十位数,用黄色表示个位数。
免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。
2、动物抓取及注射按如下图所示抓取目标动物家兔为300～600 μg/次（400），每次不超过2mL；小鼠为10～100 μg /次（10-20，20~40 μg / ml），每次不超过。
抗体效价检测步骤抗体效价检测是一种常见的免疫学实验技术，用于评估生物体中抗体的含量和活性水平。
抗体效价检测的步骤如下：1. 样品收集和制备：样品可以是血清、血浆、细胞培养上清等，其中血清样品是最常用的。
在收集血样前需要让被检测者禁食，避免食物中干扰本次实验的物质的干扰，血样采集后需要离心分离血清并进行储存处理。
2. 特异性反应物的制备：特异性反应物可以是抗原、蛋白质或者多肽，也可以是已知抗体或者纯化的Fc片段。
在制备时需要对特异性反应物进行纯化和定量化，并在实验中进行稀释。
3. 准备不同稀释度的样品：可以通过稀释血清进行准备，选用不同的稀释液，逐级进行稀释，直至达到所需的浓度。
4. 确定试验平台：抗体效价检测的平台有ELISA、Western blotting、Flow cytometry、Luminex bead-based multiplexing等，不同平台选择的特异性反应物和检测方法也不同。
5. 设定对照组及实验组：通过添加正对照组和空白对照组样品，可以保证实验结果的准确性和可靠性。
6. 进行免疫反应：将不同稀释度样品和特异性反应物共同作用于试验平台上，进行免疫反应。
7. 检测信号：根据试验平台的不同，可以使用荧光显微镜、生物发光、计数器或者吸光度计等手段检测信号。
8. 数据分析：通过计算各组试验的OD值，构建标准曲线，确定每个样品对应的抗体浓度，计算抗体效价值。
效价值表示一定体积内含有的抗体的数量。
抗体效价检测可以用于诊断疾病、研究疾病的发病机制、疫苗研发等领域，具有重要的应用价值。
但是在进行实验时需要注意反应物的纯度、样品的储存条件、平台的选择和质控等方面，以保证实验结果的准确性和可靠性。
一、实验目的本实验旨在了解抗体的制备原理和方法，掌握多克隆抗体制备过程，为后续的免疫学研究和应用提供实验基础。
二、实验原理抗体是机体免疫系统识别和清除抗原的重要物质。
抗体由B淋巴细胞分化而来的浆细胞产生，具有特异性结合抗原的能力。
根据抗体来源和特性，可分为单克隆抗体和多克隆抗体。
本实验主要制备多克隆抗体。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）抗原：猪链球菌全菌抗原（2）免疫动物：成年家兔（3）佐剂：福氏佐剂（4）抗体检测试剂：酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒2. 实验仪器：（1）恒温培养箱（2）低温高速离心机（3）酶标仪（4）微量移液器（5）恒温水浴锅四、实验方法1. 免疫动物的选择与处理选择健康的成年家兔4只，进行适应性饲养，适应新环境后，进行免疫。
2. 免疫抗原的制备将猪链球菌全菌抗原与福氏佐剂等比例混合，制备成抗原悬液。
3. 免疫注射将制备好的抗原悬液分别注入4只家兔的皮下，每组注射2ml。
注射后观察动物的反应，如有异常，及时处理。
4. 免疫程序免疫注射后，每隔7天进行一次加强免疫，共进行3次。
5. 抗体采集免疫注射结束后，于第28天采集家兔血液，分离血清。
6. 抗体检测采用ELISA方法检测血清中的抗体水平，以确定抗体产生情况。
五、实验结果与分析1. 免疫动物的反应免疫注射过程中，家兔出现不同程度的局部肿胀和红斑，但无严重反应。
2. 抗体检测ELISA结果显示，免疫后28天，家兔血清中抗体水平达到最高，表明抗体产生成功。
六、实验结论本实验成功制备了多克隆抗体，为后续的免疫学研究和应用提供了实验基础。
七、实验讨论1. 免疫动物的选择与处理选择健康的成年家兔作为免疫动物，确保实验结果的可靠性。
2. 免疫抗原的制备抗原的制备质量直接影响到抗体的产生。
本实验采用猪链球菌全菌抗原，确保抗原的有效性。
3. 免疫程序免疫程序的设置应根据抗原特性和动物个体差异进行调整，以获得最佳免疫效果。
4. 抗体检测ELISA方法具有灵敏度高、特异性强等优点，适用于抗体水平的检测。
实验一免疫抗体的制备及效价检测
一．教学目标：本实验是单克隆抗体技术的免疫阶段的过程，为单克隆抗体技术提供免疫淋巴细胞。
了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术，掌握双向
免疫扩散法测定抗体的效价。
二．重点难点：给小鼠注射抗原的实验操作，小鼠心脏取血的实验操作。
载玻片琼脂
凝胶板打孔实验操作。
三．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。
四．教学内容:
实验原理
机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。
一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。
当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。
抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。
完全福氏佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。
通常制备抗体时常用完全福氏佐剂加强免疫。
抗原、抗体在合适的浓度和比例条件下，抗原和其相应的抗体在有固相支持的液相环境中各自发生扩散。
分子双向扩散接触时形成肉眼可见的沉淀线反应。
抗体的效价即时指与固定浓度的抗原发生沉淀反应时所需的最小抗体浓度。
实验步骤
1．动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠。
免疫作好标号。
分笼饲养。
2．抗原的选择：将抗原（纤维素酶）稀释为4 mg/ml，即可与佐剂混合制成乳剂用于动物免疫。
3．佐剂和抗原乳剂的制备
佐剂完全福氏佐剂：轻矿物油（石腊油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；灭活结核杆菌10 mg。
抗原乳剂制备（1）油剂：矿物油和羊毛脂按比例混合，高压8磅20分钟灭菌后作为油剂，使用前微火融化。
（2）水剂：灭活结核杆菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均为终浓度）。
（3）油剂和水剂1：1混合。
混合方式：研磨或者注射器混合。
4．免疫方法：小鼠背部皮下多点注射，每点0.1ml。
第一次免疫：实验组小鼠加佐剂的抗原。
A组3只（头部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
B组3只（尾部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml 2mg/ml纤维素酶液。
C组6只（中部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml加佐剂的抗原乳剂。
第二次免疫：第3周实验组小鼠不加佐剂抗原。
A组3只（头部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
B组3只（尾部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml 2mg/ml纤维素酶液。
C组3只（中部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml纤维素酶液。
第三次免疫：第二次免疫后1周，实验组小鼠不加佐剂抗原。
A组3只（头部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
B组3只（尾部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml 2mg/ml纤维素酶液。
C组6只（中部有黄色）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml纤维素酶液。
5．抗血清的制备
第三次免疫一周后，眼眶取血或心脏取血。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。
在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4度冰箱保存。
6．抗体的效价检测：双向免疫扩散法。
琼脂凝胶板的制备：胶布包围一片载玻片使之形成不透水的槽。
用生理盐水加热溶解琼脂配成1%溶液，均匀浇注于玻片内。
注意勿产生气泡，琼脂厚度约2.5mm。
打孔：待琼脂凝固后，用去尖头的吸头（直径约为3-4mm）在凝胶上打孔，孔间距为3-5mm。
在小孔中加少量加热的液体琼脂，防止渗漏。
打孔样式为梅花样，如图：
加样：加样于孔内，左中间孔为抗原；右中间孔为无关抗原（牛血清白蛋白）；边孔为不同浓度的抗体（系列用生理盐水稀释的抗体1-1/2-1/4-1/8-1/16-1/32）。
注意不要外溢（加满为止）。
结果观察：加样完毕，将琼脂板平放于湿盒内，在室温或37 扩散18-24小时后，观察结果。
实验结果
要求学生观察反应结果，计算抗体的效价。
结果讨论
要求学生根据实验结果进行分析讨论
五．课堂小结：
根据学生的实验结果进展和结果进行总结。
