实验一 蛋白质的定量测定 Lowry法

Lowry法检测蛋白质的含量1. 蛋白含量检测的方法1.1 凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。

蛋白质是含氮的有机化合物。

蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。

由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

1.2 双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。

双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。

当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。

鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。

鉴定反应蛋白质单位1-10mg。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。

1.2.1 双缩脲反应双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

1.3 紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。

吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。

此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。

利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。

低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。

Lowry法检测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定。

蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。

1实验目的1.1 确保Lowry法的准确、可重复并耐用，为建立检验操作程序提供依据。

2材料与仪器2.1 待测样品：蛋白纯化后样品2.2 实验试剂100μg /ml蛋白质标准液的制备：取20.5mg BSA蛋白标准品（中检所），加入注射水 2.05ml溶解，即为10mg/ml的蛋白标储备液；在精密量取储备液液0.50ml置50ml容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，摇匀，即为100μg/ml的标准蛋白工作液。

4%碳酸钠溶液：准确称取碳酸钠4.00g，在容量瓶中定容至100ml。

0.8%氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠0.80g，在容量瓶中定容至100ml。

0.1mol/L酒石酸钾溶液：准确称取酒石酸钾2.36g，在容量瓶中定容至100ml。

0.04mol/L硫酸铜溶液：准确称取硫酸铜1.00g，在容量瓶中定容至100ml。

酚试剂：取自质检部2.3 仪器：紫外分光光度计、移液器2.4 器具：移液管、试管架、一次性吸头、卷纸3实验步骤3.1 按照下表平行配置两份蛋白质标准品溶液：3.2碱性铜溶液配制：按4%碳酸钠溶液：0.8%氢氧化钠溶液：0.1mol/L酒石酸钾溶液：0.04mol/L硫酸铜溶液=50:50:1:1的体积比进行配液（现用现配）；3.3 酚试剂：使用前，用纯水按体积比1:1稀释。

3.4取待测样品稀释至蛋白浓度在50ug/ml左右，取两支试管中，每管加入1ml 待测样品；3.5 在向每支试管中加入5.0ml的碱性铜溶液，混匀，静置10min；3.6 向每支试管中快速加0.5ml的酚试剂，混匀，室温静置30min；3.7 使用紫外分光光度计测量每管溶液在波长650nm处的吸光度。

Lowry法测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定，可检测的最低蛋白质量达5μg，通常测定范围是20~250μg。

蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。

试剂（1）酚试剂（2）碱性铜溶液：摇匀，即得。

本液应临用配制。

标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品一支，用超纯水定量稀释至1mg/ml，作为贮备液。

精密量取贮备液1.0ml置10ml离心管中，用超纯水稀释至10ml，摇匀，即为100μg/ml 的标准蛋白质溶液。

测定法准确量取超纯水1.0 ml，作空白对照。

精密量取标准蛋白质溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置于试管中，加超纯水至1.0 ml；精密量取一定体积供试品（含蛋白质50μg左右）置试管内，样品1α-IFN，分别取50ul和30ul，加超纯水至1.0 ml，稀释20倍和33.3倍；精密量取一定体积供试品2（含蛋白质50μg左右）置试管内，实验室样品2，分别取100ul和200ul，加超纯水至1.0 ml，稀释10倍和5倍；每管都加入碱性铜溶液5ml，摇匀，室温放置10分钟；快速加入酚试剂0.5ml，马上摇匀，室温放置8分钟，显色后，照紫外-见分光光度法，在波长650nm 处测定吸光度。

结果如下：以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度，求直线回归方程；将测得供试品的吸光度代入直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。

方程：y=0.0023x + 0.0261 R2 =0.9961样品1α-IFN：7号管，稀释20倍，OD值0.163，经计算x = 59.52μg/ml，样品蛋白浓度为1.190 mg/ml。

8号管，稀释33.3倍，OD值0.110，经计算x = 36.48μg/ml，样品蛋白浓度为1.216 mg/ml。

则样品1 α-IFN的蛋白浓度为1.203mg/ml。

实验一蛋白质的定量测定蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。

在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。

蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。

目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA 法，胶体金法染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。

例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA 法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。

常用的测定蛋白质含量方法的比较测定范围（μ 不同种类最大吸收波方法特点g/ml）蛋白的差异长nm 标准方法，准确，操作麻烦，费时，凯氏定氮法小灵敏度低，适用于标准的测定紫外分光光灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物100—1000 大280205 度法质有影响重复性、线性关系好，灵敏度低，测双缩脲法1000—10000 小540 定范围窄，样品需要量大Folin-酚试20—500 大750 灵敏，费时较长，干扰物质多剂法考马氏亮蓝灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会50—500 大595 G-250 转移灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时BCA 50—500 大562 较长由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250 染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。

Lowry法检测蛋白质的含量1. 蛋白含量检测的方法1.1 凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。

蛋白质是含氮的有机化合物。

蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。

由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

1.2 双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。

双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。

当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。

鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。

鉴定反应蛋白质单位1-10mg。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。

1.2.1 双缩脲反应双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

1.3 紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。

吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。

此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。

利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。

低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。

细胞因子蛋白含量（Lowry法）测定标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。

范围：适用于细胞因子原液的检定。

目的：检测细胞因子原液的蛋白质含量。

原理：lowry法是在双缩脲反应的基础上发展起来的。

是由试剂A和试剂B二部分组成。

试剂A是碱性铜试剂；试剂B含有磷钨酸和磷钼酸。

在碱性条件下，蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色的蛋白质与铜的复合物，然后此复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原试剂B中的磷钼酸-磷钨酸，产生深兰色，为钼兰和钨兰的混合物，其呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，可用比色法测定蛋白质浓度。

内容：1 材料1．1样品：经二人核对好批号后测定。

1．2试剂钨酸钠Na2WO4·2H2O 化学纯钼酸钠Na2M O O4·2H2O 分析纯磷酸H3PO4 分析纯浓盐酸HCl 分析纯硫酸锂Li2SO4 分析纯酒石酸钾钠C4H4O6KNa·4H2O 分析纯硫酸铜CuSO4 分析纯氢氧化钠NaOH 分析纯无水碳酸钠Na2CO3 分析纯溴水Br2 分析纯1．3标准品：由中国药品生物制品检定所提供。

1．4注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。

1．5其它材料：试管架、吸球、硫酸纸、药勺、记号笔、玻璃比色杯。

1．6仪器、设备紫外分光光度仪,UV-265扭力天平，TN100B冰箱，BOD-170A1．7器皿试管、量筒（250ml、100ml）、玻璃瓶（500ml、250ml）、棕色磨口瓶（50ml、500ml）、吸管（1ml、5ml、10ml），以上均由本室洗刷组处理干净。

2 方法2．1准备工作2．1．1工作环境：控制区确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌,挂上“使用中”标志牌。

2．1．2调试仪器设备2．1．2．1紫外分光光度仪，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。

2．1．2．2扭力天平，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。

2．1．2．3冰箱，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。