培养基母液配制中的若干关键环节

培养基母液配制中的若干关键环节

培养基母液,也叫浓缩贮备液.它是以培养基配方配制成的高倍的浓缩液,不同组分母液,它的浓缩倍数不同,一般最低为10倍,高的有50倍、100倍、200倍,甚至1000倍.母液是一个方法比较简便、用量比较准确且被广泛采用的配制方法.本文就如何掌握培养基母液配制的操作要领作一阐述,以供参考.

以MS培养基为例,其母液的配制包括大量元素、微量元素、铁盐、维生素、氨基酸、植物生长调节物质和有机附加物等种类.（见表1）

1 大量元素和微量元素母液的配制

按规定用量,称取所需的各种药品,在配制时为减少工作量,可以把几种药品（如大量元素或微量元素）配在同一母液中（见表1）.但由于各种药品的混合,可能发生反应,生成沉淀物,以致母液失效.为避免类似现象发生,在大量元素、微量元素和维生素及氨基酸的母液配制时，可采用如下2种做法加以解决：①将要配在同一母液的大量元素、微量元素和维生素及氨基酸等化合物,按“表1”所列药品的先后顺序溶解药品,待前一种药品完全溶解后再加入后一种化学药品，以此类推；②使每种成份分别完全溶解,再把它们彼此混合.

2 铁盐母液的配制

铁盐的成份含硫酸亚铁（FeSO4-7H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）.这两种化合物的溶解和混合较为严格,必须按如下方法配制,否则将会产生沉淀.该方法是：分别溶解FeSO4-7H2O和Na2-EDTA,加热并不断搅拌,使之完全溶解,冷却，将2种溶液混合,调PH至5.5,用蒸溜水加至所需容积,棕色瓶保存于冰箱之中.

3 植物生长调节物质母液的配制

植物生长调节物质是培养基的重要组分之一,一般是植物激素类物质,如生长素类的IAA、IBA、NAA,赤霉素类的GA3,细胞分裂素类的2,4-D、KT和6-BA等.由于大多数生长调节物质难溶于水,因此配制方法也各不相同：①IAA,IBA和GA3先用少量95%酒精溶解,再加水定容，摇匀后贮于试剂瓶中、贴上标签后，存放在冰箱中；②NAA可用热水或少量95%酒精溶解,再加水定容至所需容积；③2,4-D可溶于少许0.1mol-L-1的NaOH溶液中,然后加水定容；④KT和6-BA可用少量0.1mol•L-1的HCl溶解,再加水定容；⑤玉米素先溶于少量95%酒精中,然后加水定容.

植物生长调节物质浓度通常用ppm（mg•ml-1）和mol•L-1表示,在配制母液时，常以ppm较为方便,一般配制成0.5ppm的母液,这个浓度既便于计算,也可避免冷藏时形成结晶.4有机附加物母液的配制在植物组织培养时,培养基中往往要加入一些有机附加物,如椰子汁,以促进组织培养活性.由于椰子汁的活性成分是耐热的,在配制时,要先把由果实中采集到的汁液加热煮沸以除去其中的蛋白质,过滤,然后置塑料瓶中贮存于的-20℃的低温冰箱内.MS培养基配制中的五点注意

1 母液配制必须严格分类

配制高浓度的母液是植物组织培养的基本功。配制母液的目的，除了多次取用、节省实验准备的时间外，还有抑制杂菌生长的作用。高浓度的母液能够有效地抑制细菌与霉菌的生长，加上低温环境(4℃)，能够大大增加培养基的存放时间(一年左右)。一般而言，培养基中的各个成分可以按照表1的分类方式配成母液。

总类别 母液倍数 分类别 成分

一旦二主大量元素 10-25倍 大量元素-1 NH4NO3,KNO3,KH2PO4

大量元素-2 CaCl

2

大量元素-3 MgSO

4

微量元素 20-50倍 微量元素-1 MnSO4,ZnSO4,CuSO4

微量元素-2 H3BO3,Na2MoO4,.CoCl2

微量元素-3 KI

铁盐 10-25倍 铁盐 EDTA-Na2,FeSO4

有机附加物 10-25倍 甘氨酸 甘氨酸

烟酸 烟酸

肌醇 肌醇

维生素B1 维生素B1

维生素B6 维生素B6

注：“母液倍数”为笔者建议，具体浓度应以具体用量为准。

按照表1的要求，每一个“分类别”为一瓶母液，按照相应的成分配制好后，4℃避光保存，用时按照母液倍数进行稀释即可。 母液分类的依据，是要避免MS培养基中某些成分发生沉淀反应。例如，如果将全部的大量元素混合在一起配制，则KH2PO4和CaCl2易产生Ca3（PO4）2沉淀，而CaC1jDMgSO4将生成CaSO4沉淀。

除上述成分外，还必须加上蔗糖、琼脂以及激素，才构成用于组织培养的MS培养基。

2 激素的溶解方法

MS培养基中常用的激素，如2,4-D、NAA、6-BA,也要配制成10〜20倍母液，这样便于称量（激素的用量极小，给称量造成不便），且可以多次取用。激素的配制与一般的药品不同，需要助溶剂。

如要配制10mL的1mg/mL2,4-D母液，则应称取0.01g2,4-D固体，置于小烧杯中，再以1〜3mL的95%乙醇（或0.1mol/LNaOH）溶解，最后缓慢加入蒸馏水定容。即每加入1mL蒸馏水，立即搅拌均匀，使白色沉淀消失。重复数次,直至定容。

一般而言，生长素类物质2,4-D、NAA）要用95%乙醇（或0.1mol/LNaOH）助溶，而细胞分裂素类物质（如6-BA）要用0.1mol/L的HC1助溶。助溶剂的用量一定要小,不能因其溶解效果好而过量使用,否则将影响培养基的质量（改变培养基成分或pH值）。配制好的激素要常温避光保存，尽快使用（尽量不超过一个月）。将激素母液保存在4℃冰箱中,希望获得较长的保存时间。但事实上这种做法是不可取的,因为激素在低温环境中易析出沉淀,影响使用效果。

3 危险药品的使用与保管

尽管组织培养技术已经相当成熟,也很普及,但该技术并不安全。除注意灭菌锅、超净台等大型仪器的使用安全外,最重要的当属危险药品的使用与保管。

原则上，MS培养基中任何一种药品都有一定的危险性。现只把最突出、最需要预防的药品注释如下。

（1）NH4NO3、KNO3 此两种药品为易爆品，取用时一定要轻拿轻放，保存在阴凉处。另外，目前NH4NO3,的购买受到一定的限制，也可以考虑使用其他培养基，如N6或B5培养基，无NH4NO3成分，亦为组织培养所常用。

（2） EDTA-Na2、CoC12、2，4-D此三种药品为致癌物，配制时要带胶皮手套，或两层塑料手套。EDTA-Na为金属螯合剂，有一定的粘性；CoCl2能够导致基因突变，遗传学实验中也常用其作为致突变剂；2,4-D是高效农药，对人的皮肤有伤害作用。

4 热水定容原则

在母液、激素、蔗糖、琼脂都加入后，很多人习惯用微波炉或电磁炉加热溶解培养基（特别是琼脂）。培养基熔化后，由于水分的蒸发，会造成体积的减少，从而需要定容。这时一定要用热水（60℃左右）进行定容，切忌用冷水（30℃以下），否则培养基中局部的琼脂将凝固，造成营养成分浓度不均。

5 关于调节pH

适合的pH保证了营养成分的正常发挥，也决定了培养基的硬度（偏酸则过软，偏碱则过硬，都不利于组织的生长），故要十分留意。对于MS培养基而言，只要各个成分按照用量精确加入，并且在熔化培养基时加热时间适合（平均100mL培养基加热60〜90s，保证完全熔化的同时，尽量限制加热时间），则培养基的pH自然地将处于最适范围内。调解pH时最好用电子pH计，以保证精确度。pH试纸的误差较大，要小心调节。可以将pH调到比最适值小一些，因为培养基在灭菌后，pH将变大。

电子天平操作规程

1开机

1.1 检查天平电线是否连接好电源。

1.2 检查天平水平仪中的空气泡是否在内圈中部，若不在则调节天平后座脚螺丝使其在正中。

1.3 查看天平室内干燥剂是否变色，若变色，换活化后的干燥剂。 1.4 打开电源，按〔on/off〕键，开启天平，预热120分钟。

2 一般称重

2.1 待天平稳定后，出现0.00000g，长按t键，转换所需的称量单位。

2.2 将容器放置称盘正中央，待g出现后，即为容器的重量。

2.3 按t键去皮，将天平显示置归零。

2.5 置入欲称的样品，待g出现后，即是样品的重量。

2.6 重复2.2〜2.5称取其它物品。

2.7 称量完毕，按〔on/off〕键关机。

3 天平校正

3.1 选择校正模式

首次接通电源，待天平预热120分钟后，开机，立即按住menu键不放，2秒后，出现setconfiguration,再放开menu键，按J键3次，直到出现setcalibration后，按回车键，选择校正模式：external（外砝码校正）internal（内砝码校正）。

3.2 内砝码校正

移走称盘上所有东西，按住t键不放，直到出现calibration再放手，天平开始闪烁，约过十几秒，天平停止闪烁，校正完毕。

3.3 外砝码校正

移走称盘上所有东西，按住t键不放，直到出现calibration再放手，0点开始闪烁，之后出现一100,置入100g标准砝码，约过十几秒，天平停止闪烁，移走砝码，校正完毕。

4 注意事项

4.1 天平应放置在无振动位置，尽可能的水平，称量时也应轻拿轻放。

4.2 不能称取超出最大称量范围（205g）的物品。

4.3 称量完毕，卸下载物，用软毛刷做好清洁工作，并关闭天平门盖。

4.4 天平每次放置新位置时，应该调节水平。

5 维护方法

5.1 避免阳光直射。

5.2 平时天平室内应放置活化好的干燥剂，保持天平室内的干燥。

5.3 请不要用包含溶剂或研磨剂的清洁剂，其将导致操作平台的薄膜损坏。

5.4 请注意勿让液体渗透进天平。

5.5 使用者请不要维修，保养与替换天平的任何部件。 容量瓶的使用方法及注意事项

容量瓶主要用于准确地配制一定摩尔浓度的溶液。它是一种细长颈、梨形的平底玻璃瓶，配有磨口塞。瓶颈上刻有标线，当瓶内液体在所指定温度下达到标线处时，其体积即为瓶上所注明的容积数。容量瓶的容积比量筒准确，用于配制一定体积、一定物质的量浓度的溶液。容量瓶不能配制其容积以下体积的溶液，即其容积为多大，就只能配制多大体积的溶液。常用的容量瓶有100、250、500、1000毫升等多种规格。

使用容量瓶配制溶液的方法是：

(1)使用前检查瓶塞处是否漏水。具体操作方法是：在容量瓶内装入半瓶水，塞紧瓶塞，用右手食指顶住瓶塞，另一只手五指托住容量瓶底，将其倒立(瓶口朝下)，观察容量瓶是否漏水。若不漏水，将瓶正立且将瓶塞旋转180°后，再次倒立，检查是否漏水，若两次操作，容量瓶瓶塞周围皆无水漏出，即表明容量瓶不漏水。经检查不漏水的容量瓶才能使用。

(2)把准确称量好的固体溶质放在烧杯中，用少量溶剂溶解。然后把溶液转移到容量瓶里。为保证溶质能全部转移到容量瓶中，要用溶剂多次洗涤烧杯，并把洗涤溶液全部转移到容量瓶里。转移时要用玻璃棒引流。方法是将玻璃棒一端靠在容量瓶颈内壁上，注意不要让玻璃棒其它部位触及容量瓶口，防止液体流到容量瓶外壁上

(3)向容量瓶内加入的液体液面离标线1厘米左右时，应改用滴管小心滴加，最后使液体的弯月面与标线正好相切。若加水超过刻度线，则需重新配制。

(4)盖紧瓶塞，用倒转和摇动的方法使瓶内的液体混合均匀。静置后如果发现液面低于刻度线，这是因为容量瓶内极少量溶液在瓶颈处润湿所损耗，所以并不影响所配制溶液的浓度，故不要在瓶内添水，否则，将使所配制的溶液浓度降低。