实验七酵母rna的提取及鉴定.doc
一、实验原理
RNA是核酸的一种，在细胞中负责遗传信息的传递和蛋白质的合成。RNA可分为信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)等多种类型，酵母菌中大部分RNA是rRNA和tRNA，也存在少量的mRNA。提取酵母RNA需要破解细胞壁和细胞膜等结构，并且细胞内含有大量核酸酶，因此提取纯度较高的RNA比较困难。
RNA的提取可以通过化学方法和物理方法两种方式实现。化学方法主要是利用离子交换、酚-氯仿提取、硅胶柱层析等技术，较为复杂且需要一定的技术经验；物理方法主要是利用超声波、玻璃珠破碎法等技术，可以快速有效地提取RNA。本实验采用物理法加化学法结合的方法提取酵母RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和完整性。
二、实验步骤
2.1 材料准备
(1) 酵母菌法国版工业菌株(Saccharomyces cerevisiae);
(2) TRIzol试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司);
(3) 稀释HCl溶液(3 mol/L);
(4) 75%(w/v)的酸性酚;
(5) 氯仿;
(6) 层析级异丙醇;
(7) 等电聚丙烯酰胺缓冲液(pH 7.0，0.025 mol/L Tris/HCl，0.192 mol/L草酸二钠，0.0025 mol/LEDTA)。
2.2 RNA提取
(1) 取一支含3 mL YPD液体培养基的酵母菌液，在恒温摇床上培养至OD600=0.8-1.0。收集菌体，迅速离心10 min，将菌体沉淀在低温下保存。
(2) 在无菌条件下，向2mL微离心管中加入500μl冰冻的脚本称重的玻璃珠，加入250μl TRIzol试剂，加入500μl氯仿混合液(高速离心样品质量的20%)。
实验4 酵母RNA的分离及组分鉴定
酵母RNA是由酵母细胞合成的核糖核酸，包含了酵母细胞的遗传信息，并参与了细胞的生理代谢过程。本实验旨在通过离心分离和酸性酚/氯仿法提取，纯化酵母RNA，并通过紫外吸收光谱和琼脂糖凝胶电泳等方法对酵母RNA进行组分鉴定。
一、材料与方法
1.材料
酵母细胞、DTT、Tris、EDTA、NaCl、硝酸、醋酸等。
2.方法
1)制备样品
a.在液氮中将酵母细胞粉磨成细粉；
b.称取10mg酵母细胞粉末加入1ml去离子水中，振荡混匀，制成1mg/ml的酵母细胞悬液。
2)离心分离
a.取1ml稀释后的酵母细胞悬液，离心10000rpm/10min，弃去上清液；
b.用10μl无菌去离子水重悬沉淀，制成1mg/ml的RNA悬液。
3)RNA的提取和纯化
a.取1ml离心沉淀物加入700μl去离子水，混合均匀，加入100μl10%SDS和100μl酸性酚(pH4.5)混合，振荡15min；
b.加入300μl氯仿，振荡混合，离心12,000g/10min；
c.取上层水相(约600μl)，加入等量异丙醇混合，振荡；
d.离心12,000g/5min，弃去上清液，将胶状RNA沉淀用70%酒精重悬，制成1mg/ml的RNA溶液。
4)鉴定RNA
a.测定RNA含量和纯度
b.通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带。 c.用紫外吸收光谱测定RNA吸收光谱曲线。
5)结果分析
a.通过鉴定RNA的吸收峰和电泳图谱来分析RNA组分。
二、实验结果
1.酵母RNA提取和纯化效果良好，制得1mg/ml的RNA溶液。
2.根据紫外吸收光谱结果，可以看到RNA在260nm的吸收峰高于280nm，证明纯化后的RNA具有良好的纯度。
实验内容：鲫总RNA的提取与热休克蛋白基因的克隆
热休克蛋白( heat shock protein , HSP) 又称为应激蛋白,是生物细胞（包括原核细胞及真核细胞）在受热、生物应激、理化因素等应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的一类在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白。
热休克蛋白 是细胞在生理状态下必需而在应激状态时表达增多的一类保护性蛋白质，热休克蛋白对生体的意义是，可提高机体对不良环境的耐受性，保护机体或细胞在随后的致死性应激中不受或少受伤害，同时还具有保护、修复蛋白质，参与机体免疫、交叉保护等特性。。热休克蛋白根据其同源性及分子质量大小可分为3 个主要家族: HSP90 (85-90 ku) 、HSP70 (68-73 ku) 和小分子质量热休克蛋白。其中以HSP70 最为保守,研究的也最广泛，常被作为应激反应的分子指标。
一. 主要酶和试剂
Trizol Reagent、禽源反转录酶（AMV）、DEPC、Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、DNA Marker（DL2000）。
二．所需试剂的配制：
DEPC处理水（0.1‰）：1000 mL双蒸水中加入0.1 mL DEPC，过夜温育后高压灭菌。
1.5％琼脂糖：向100 mL的1×TAE中加入1.5g的琼脂糖。
50×TAE：750 mL双蒸水中溶解242 g Tris碱，加入57.1 mL乙酸，100 mL的0.5 mol/L 的EDTA（pH8.0），用双蒸水定容至1000 mL。使用时用双蒸水稀释为1×TAE。
三. 仪器与设备
PCR扩增仪；微量核酸蛋白检测仪；紫外凝胶成像仪；电热恒温水浴锅；制冰机；稳压稳流电泳仪；微型水平电泳槽
四. 实验方法
实验开始前，要将枪头、匀浆器等用0.1％DEPC水浸泡12h以上，然后高压灭菌、烘干机烘干（需提前准备）
1． 总RNA的提取
用TRIzoL Reagent试剂盒并按其说明书提取总RNA，其具体操作步骤如下：
小麦总RNA提取试剂
1）RNA 提取采用试剂Trizol Reagent (购自invitrogen公司)
2）氯仿；异丙醇；70 % 乙醇；0.1 % DEPC；DEPC处理的超纯水
小麦幼苗总RNA的提取
实验用品的处理：离心管、枪头等塑料制品用0.1 % DEPC于 37 ℃浸泡2h，和0.1 %的DEPC水高压灭菌30min，研体、剪刀、镊子、容量瓶等180℃烘烤6h。
1） 称取100 mg小麦叶片，液氮研磨至粉末状，迅速转入含1mL Trizol的1.5 ml离心管中，混匀，室温下静置5 min。
2）加0.2 ml氯仿，剧烈振摇15 sec，20 ℃静置3 min。
3）然后在4℃，12000 rmp 离心10 min，吸取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，置于-20℃放置30 min。
4）在4℃，12000 rmp 离心10 min，弃去上清液，沉淀中加1mL 75% 乙醇洗涤2次。
5）4℃，12000 rmp 离心5 min，弃去上层乙醇，放置几分钟，等乙醇挥发完加入50uL DEPC 水溶解RNA，并迅速置于-70℃存放。
6）取上述RNA提取溶液，1 %琼脂糖电泳检测。
双灭：30min 121℃ 不开盖，气压降到O℃。枪头（蓝白黄）、1.5ml 离心管、PCR管、剪刀、镊子(2-3)、研钵（2-3)
液氮提前检测
灭一次：先DEPC（1:10）乙醇，然后上述混合液与ddH2O 1:100混溶，100ml。
PCR 体系：模板1μL cDNA、 UpperPrimer（10μM ）1.0μL，Lower Primer（10μM ）1.0μL，
mix 8μL，加 H2O 9 μL。PCR反应参数为：94℃ 预变性5min ；94℃变性 1min ，57℃退火 1min ，72℃延伸1min，循环35次 ；72℃延伸 10 min ；4 ℃保存。
