实验七酵母rna的提取及鉴定.doc
一、实验原理
RNA是核酸的一种，在细胞中负责遗传信息的传递和蛋白质的合成。RNA可分为信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)等多种类型，酵母菌中大部分RNA是rRNA和tRNA，也存在少量的mRNA。提取酵母RNA需要破解细胞壁和细胞膜等结构，并且细胞内含有大量核酸酶，因此提取纯度较高的RNA比较困难。
RNA的提取可以通过化学方法和物理方法两种方式实现。化学方法主要是利用离子交换、酚-氯仿提取、硅胶柱层析等技术，较为复杂且需要一定的技术经验；物理方法主要是利用超声波、玻璃珠破碎法等技术，可以快速有效地提取RNA。本实验采用物理法加化学法结合的方法提取酵母RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和完整性。
二、实验步骤
2.1 材料准备
(1) 酵母菌法国版工业菌株(Saccharomyces cerevisiae);
(2) TRIzol试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司);
(3) 稀释HCl溶液(3 mol/L);
(4) 75%(w/v)的酸性酚;
(5) 氯仿;
(6) 层析级异丙醇;
(7) 等电聚丙烯酰胺缓冲液(pH 7.0，0.025 mol/L Tris/HCl，0.192 mol/L草酸二钠，0.0025 mol/LEDTA)。
2.2 RNA提取
(1) 取一支含3 mL YPD液体培养基的酵母菌液，在恒温摇床上培养至OD600=0.8-1.0。收集菌体，迅速离心10 min，将菌体沉淀在低温下保存。
(2) 在无菌条件下，向2mL微离心管中加入500μl冰冻的脚本称重的玻璃珠，加入250μl TRIzol试剂，加入500μl氯仿混合液(高速离心样品质量的20%)。
rna的提取与鉴定实验报告
实验步骤 操作细节与试剂 数据记录 结果与分析
1.
实验准备 - 仪器：紫外分光光度计、离心机、水浴锅等-
试剂：酵母粉、NaCl、HCl、乙醇、氨水、RNA沉淀剂等 - 无具体数据记录 - 确保仪器和试剂准备齐全，质量可靠
2.
酵母核糖核酸的提取 - 称取一定量干酵母粉，加入蒸馏水和特定试剂- 沸水浴处理，离心分离- 加入乙醇沉淀RNA，离心收集沉淀 - 酵母粉质量：-
沸水浴时间：- 离心转速和时间：-
乙醇体积和洗涤次数： - 提取的RNA沉淀量（通过观察或称重）- 提取过程中可能的损失和干扰因素 3.
RNA的纯化 - 使用特定试剂（如异硫氰酸胍-苯酚-氯仿）进行抽提- 或根据RNA在等电点的pH环境下溶解度最小进行纯化 - 纯化试剂的种类和用量：- pH调节范围和纯化时间： - 纯化后RNA的纯度（通过OD260/OD280比值测定）- 纯化过程中可能的杂质去除情况
4.
RNA含量的测定 - 使用紫外分光光度计测定RNA在260nm处的吸光度- 根据标准曲线计算RNA浓度 - OD260值：- 标准曲线方程：- RNA浓度（μg/ml）： - 测定结果的准确性和可靠性- 与标准RNA液的浓度对比
5.
RNA的鉴定 - 进行磷酸的检测、核糖的显色反应以及嘌呤碱基的检测等化学反应-
观察颜色变化或生成物 - 磷酸检测结果：-
核糖显色反应结果：- 嘌呤碱基检测结果： - 鉴定结果的准确性和可靠性- RNA组分的完整性和稳定性 6.
数据整理与分析 - 整理实验数据，计算RNA的纯度、提取率和产率等 - RNA纯度（%）：- RNA提取率（%）：- 总制品重量和产率： - 分析实验结果的可靠性和准确性-
讨论可能的误差来源和改进措施
7.
结论与展望 - 总结实验过程和结果，得出实验结论- 提出改进方法和未来研究方向 - 实验结论：- 改进建议：- 未来研究方向： - 对实验结果的全面评价- 对未来研究的展望和建议
关于RNA质量鉴定的经验：
1）检测RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280
（Ratio，R）。1.8-2.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
2）RNA的电泳图谱一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的。此主题相关图片如下：以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有
非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。
3）保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
实验一 植物基因组DNA的提取
一、实验目的
掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum
bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
三、实验材料
水稻幼叶
四、主要试剂配方
2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M
EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇
（400ul）
氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。
五、实验步骤
1. DNA的提取
（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。
（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；
（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；
（4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；
