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实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
一、目的要求
学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法；了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。
二、实验原理
酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
三、器材与试剂
1〉材料
酵母粉。
2〉器材
乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。
3〉试剂
(1)
0.04mol/L氢氧化钠溶液。
(2)酸性乙醇溶液：将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。
(3)95%乙醇。
(4)乙醚。
(5)
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1.5mol/L硫酸溶液。
(6)浓氨水。
(7)
0.1mol/L硝酸银溶液。
(8)三氧化铁-浓盐酸溶液：
将2ml 10%三氧化铁溶液(用FeCl
3·6H
2O配制)加入到400ml浓盐酸中。
(9)苔黑酚乙醇溶液：
溶解6g苔黑酚于100ml 95%乙醇中。
(10)定磷试剂。
a.17%硫酸溶液：
将17ml浓硫酸(比重
1.84)缓缓加入到83ml水中。
b.
2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。
c.10%抗坏血酸：
将10g抗坏血酸溶于100ml水中，储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效。
临用时将上述3种溶液与水按比例混合：17%硫酸溶液︰
2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。
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四、实验步骤
1〉RNA提取
将10g酵母悬浮于90ml
0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。(3000r/min)离心10分钟，将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA，可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。
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一、实验目的
1.了解并掌握稀碱法提取核酸的原理和方法。
2.学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。
3.了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。
二、实验原理
核酸是一类不稳定的生物大分子，在制备过程中很容易发生降解。因此，要使制得的核酸尽可能保持其在生物体内的天然状态，制备核酸必须采用温和的条件。酵母核酸中RNA含量较多，RNA达
2.67-
10.0%，而DNA含量仅为
0.03-
0.516%，酵母核酸的提取方法较多，工业上一般选用成本较低、适宜于大规模操作的稀碱法和浓盐法。稀碱法是用1％NaOH溶液，将细胞壁溶解，用酸中和，升高温度使蛋白质变性，将蛋白质与核酸分离，然后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH
2.5），使核酸沉淀出来。稀碱法的优点是抽提时间短，但核酸在此条件下不稳定，容易分解。
血球计数板法主要计数酵母、原生动物等个体较大的微生物，是计数一定容积中的细胞总数的常用方法。其型号分为X
B.K.
25.和X
B.K.
16.两种，前者是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；后者为一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方
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格。但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为
0.1mm，所以计数室的容积为
0.1mm3（万分之一毫升）。
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。RNA的紫外吸收高峰在OD260nm波长处。一般在OD260nm波长下，每毫升含1μgRNA溶液的吸光值为
0.022。故测定未知浓度RNA溶液OD260nm波长的吸光值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等各组分，加入硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。磷酸与定磷试剂作用可以生成蓝色的钼蓝。核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。嘌呤碱与硝酸银反应能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。
※实验六 酵母RNA的分离及组分鉴定
【实验目的】
了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。
【实验原理】
酵母核酸种RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
鉴定依据：磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。
【实验器材】
150 ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶 、吸管 7、滴管8、试管及试管架 9、烧杯 、离心机、漏斗
【试剂和材料】
1、 0.04 mol/L氢氧化钠溶液；
2、酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中；
3、95%乙醇；
4、乙醚；
5、1.5 mol/L硫酸溶液；
6、浓氨水；
7、0.1 mol/L硝酸银溶液；
8、三氯化铁浓盐酸溶液：将2 ml 10% 三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400
ml浓盐酸中；
9、苔黑酚（地衣酚）乙醇溶液：溶解6 g苔黑酚于100 ml 95% 乙醇中（可在冰箱中保存一个月）；
10、定磷试剂：（1）17% 硫酸溶液：将19 ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83 ml水中（2）2.5% 钼酸铵溶液：将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中（3）10% 抗坏血酸溶液：10
g抗坏血酸溶于100 ml水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸）。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17% 硫酸溶液：2.5%
钼酸铵溶液：10% 抗坏血酸溶液：水=1：1：1：2 (V/V)；
11、酵母粉。
【实验操作】
1、溶解RNA
将5 g酵母悬浮于90 ml 0.04 mol/L 氢氧化钠溶液于150 ml锥形瓶中，在沸水浴中加热30分钟，制成碱提取液，将其冷却。
酵母RNA的提取（浓盐法）及成分鉴定
一、实验目的：
1、掌握浓盐法提取RNA的原理和方法。
2、理解等电点沉淀分离两性物质的原理和基本操作。
3、掌握钼蓝反应的原理，了解戊糖和嘌呤检验的原理。
二、实验原理：
1、浓盐法提取酵母RNA：
酵母中RNA含量特别多，约占干重的3～10％，DNA含量很少，约占干重的
0.5％或更少，且菌体容易收集（即可利用发酵工业的下脚料），因此多采用酵母
来提取RNA。；
本实验采用工业上常用的浓盐法，其基本原理是在浓盐加热的条件下酵母细
胞壁通透性增加或发生破损，且加热又可使酵母中蛋白质变性沉淀，使RNA以可
溶性钠盐的形式游离析出。离心去除菌体，将上清液调至RNA的等电点（pH2～
2.5），使RNA沉淀析出，离心收集沉淀。
2、RNA成分鉴定:
RNA酸解，其水解产物含有碱基+核糖+磷酸；
碱基（嘌呤）：
磷酸：
核糖：戊糖在约12％的盐酸中可以发生脱水缩合成为糠醛，糠醛可与5-甲
基间苯二酚(又称苔黑酚、地衣酚)缩合生成蓝绿色的物质。该反应用于检验戊糖
的存在。
三、实验步骤：
1.浓盐法提取酵母RNA
（1）RNA的提取：取干酵母一包（约1～2g）放入100mL锥形瓶内，加入
10％NaCl溶液30mL，搅匀后将锥形瓶固定在水浴锅内，于沸水浴中加热40
分钟。
（2）RNA的离心分离：将上述锥形瓶从沸水浴中取出，立即用自来水冷却
至室温。然后将锥形瓶内溶液倒入离心管，平衡后3000转／分离心10分钟,收
集上清液。
（3）RNA的收集：将上清液小心倾入50mL烧杯内，在冰浴中冷却。用
6mol/LHCl溶液调pH值至RNA的等电点2.0～2.5（一滴一滴的加入，边加边搅
拌，随着pH下降，白色RNA沉淀逐渐增加，至等电点时沉淀最多）。静置冰浴中
5分钟使沉淀完全，颗粒变大。再经3000转／分离心10分钟，收集沉淀。
2.RNA成分鉴定
（1）溶解RNA：在离心所得的含RNA的离心管中加入1滴蒸馏水，用玻
