实验蛋白质的沉淀反应与颜色反应
一、实验目的
掌握鉴定蛋白质的原理和方法。熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步熟悉蛋白质的有关反应。
二、实验原理
蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。
三、实验仪器
1、吸管
2、滴管
3、试管
4、电炉
5、pH试纸
6、水浴锅
7、移液管
四、实验试剂
1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。
2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。
3、Millon’s试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。
4、尿素晶体
5、1%CuSO
4：1g CuSO
4
晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml
6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml
7、浓硝酸
8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.
9、冰醋酸
10、浓硫酸
11、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。
12、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。
13、95%乙醇。
14、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml
15、氯化钠晶体
16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml
17、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。
18、1%醋酸溶液。
五、实验步骤
蛋白质的颜色反应
（一）米伦（Millon’s）反应
1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millon’s试剂0.5ml，电炉小心加热观察颜色变化。
2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加Millon’s试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，观察现象。
（二）双缩脲反应
1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热熔化，至重新结晶时冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察现象。
2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察现象。
（三）黄色反应
取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，观察颜色有什么变化。
（四）茚三酮反应
取蛋白液1ml于试管中，加4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。
蛋白质的沉淀
（一）蛋白质的盐析作用
1、试管中加蒸馏水3ml，加固体硫酸铵至饱和。另一支试管加蛋白液2ml，再加入饱和硫酸铵溶液2ml，摇匀静置观察现象。
2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。
（二）有机溶剂沉淀蛋白质
试管中加蛋白液1ml，加晶体氯化钠少许，溶解后加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。
（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质
1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。
2、取一支试管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混匀，观察结果。
（四）生物碱试剂沉淀蛋白质
取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，观察现象。
六、实验结果
蛋白质的颜色反应
（一）米伦（Millon’s）反应
1、苯酚实验：
溶液即出现玫瑰红色。
2、蛋白质实验：
出现白色的蛋白质沉淀，小心加热后凝固的蛋白质出现红色。
（二）双缩脲反应
1、有紫色出现。
2、溶液有蓝紫色出现
（三）黄色反应
先有黄色沉淀生成，加入10%NaOH溶液1ml后颜色变为橘黄色。
（四）茚三酮反应
有蓝紫色出现。
蛋白质的沉淀
（一）蛋白质的盐析作用
1、有蛋白析出。
2、有蛋白质析出，加水后可复溶。
（六）有机溶剂沉淀蛋白质
取一试管加蛋白液1ml，，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象
（七）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质
取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。
（八）生物碱试剂沉淀蛋白质
取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸和鞣酸数滴，观察现象。
七、实验分析
蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。
其中米伦试剂能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应，而组成蛋白质的氨基酸中酪氨酸含苯酚基团，因此可用米伦试剂检测蛋白质中酪氨酸的存在。尿素被加热，形成双缩脲，在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，也能进行此反应。蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应
蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相
互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。
