蛋白质的颜色反应和沉淀反应

实验四
蛋白质的颜色反应 和沉淀反应
可编辑ppt
1
一、实验目的
1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应 2.了解蛋白质的沉淀反应、颜色反应的机理。
可编辑ppt
2
二、实验原理
（一）蛋白质的颜色反应原理
蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产
生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不
完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋
3.1%醋酸铅溶液 4.1%硫酸铜溶液 5.0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于95%乙醇并稀释至
100mL。 6.浓硝酸：比重1.42。 7.试管及试管架、吸管、量筒等。
可编辑pptwenku.baidu.com
7
四、操作步骤 (一)蛋白质的颜色反应
1.双缩脲反应
原理：当尿素经加热至180℃左右时，两分子尿 素脱去一分子氨，进而缩合成一分子双缩脲。在 碱性条件下双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物， 此反应称为双缩脲反应。多肽及蛋白质分子结构 中均含有许多肽键，其结构与双缩脲分子中的亚 酰胺键相同。因此，在碱性条件下与铜离子也能 呈现出类似于双缩脲的呈色反应。
可编辑ppt
8
可编辑ppt
9
实验过程
①取少许结晶尿素放在干燥试管中，微 火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的 氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白 色固体出现，停止加热，冷却。然后加 10%NaOH 溶液1mL 混匀，观察有无紫色出 现。
②另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加 10% NaOH 溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴， 混匀，观察是否出现紫玫瑰色。
可编辑ppt
10
2.蛋白质的黄色反应
实验原理：含有苯环结构的氨基酸，如酷氨酸和 色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化 合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄 色反应(苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才 有黄色反应)。
可编辑ppt
11
可编辑ppt
实验原理：蛋白质在碱性溶液中，带有较 多的负电荷，当与带正电荷的重金属离子 结合时，即生成不溶于水的沉淀。
可编辑ppt
21
实验过程
取2支试管各加蛋白质溶液2mL，一管内滴 加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加10%硫酸 铜溶液，观察沉淀生成。
可编辑ppt
22
可编辑ppt
17
实验过程
取1支试管加入3mL 蛋白质溶液和3mL 饱和 硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白 则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵 粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不 再溶解达到饱和为止，析出的沉淀为清蛋 白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。
可编辑ppt
18
2.乙醇沉淀反应
可编辑ppt
5
蛋白质变性后,有时由于维持溶液稳定的条件 仍然存在(如电荷),并不析出.因此变性蛋白 质并不一定都表现为沉淀,而沉淀的蛋白质 也未必都已变性.
可编辑ppt
6
三、实验仪器、试剂和材料
1.卵清蛋白液：将鸡蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3 层纱布过滤，滤液冷藏备用。
2.饱和硫酸铵溶液：称硫酸铵850g 加于1000mL 蒸馏水中， 在70～80℃下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出 白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。
12
实验过程：
在一试管内，加蛋白质溶液10滴及浓硝酸 3～4滴，加热，冷却后再加10%NaOH 溶液 5滴，观察颜色反应。
可编辑ppt
13
3.茚三酮反应
实验原理：在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或 氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。 此反应为一切蛋白质和α—氨基酸所共有(亚氨基 酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)。含有 氨基的其他化合物亦可发生此反应。
可编辑ppt
4
蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因， 是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电 荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距 离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形 成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋 白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质 胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
原理：在水溶液中，蛋白质分子由于表面 生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶 体颗粒。在有机溶剂中，蛋白质颗粒因失 去电荷或脱水而沉淀。
可编辑ppt
19
取1支试管架蛋白质溶液1mL，加晶体氯化 钠少许(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再 加入95%乙醇2mL 混匀。观察有无沉淀析出。
可编辑ppt
20
3.重金属盐沉淀反应
可编辑ppt
14
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化
形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还 原型茚三酮;第二步是所形成的还原型茚三酮同 另一个水合茚三酮分子和氨缩合成有色物质。
可编辑ppt
15
实验过程：
取1mL 蛋白质溶液置于试管中，加2滴茚三 酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现(注意： 此反应必须在pH5～7进行)。
白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相
同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果
决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常
用的蛋白质定量测定的依据。
可编辑ppt
3
（二）蛋白质的沉淀反应原理
蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体， 这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如 -NH3+，-COO-，-SH等和水有高度亲和性，当蛋 白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋 白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜 的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞 而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而 不会沉淀。
可编辑ppt
16
(一)蛋白质的沉淀反应
1.盐析作用原理
用大量中性盐(如硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等)，使 蛋白质沉淀析出的过程，称为蛋白质的盐析作用。它包 括两个过程：一是电解质破坏了蛋白质的水化层而出现 沉淀；二是电解质中和了蛋白质分子所带的电荷而出现 沉淀。
中性盐能否沉淀各种蛋白质与中性盐的浓度、蛋白 质的种类、溶液的pH值以及蛋白质胶体颗粒大小有关。 大颗粒蛋白质胶体比小颗粒更容易沉淀，如球蛋白多在 半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶 液中才能析出。