蛋白质分离与纯化
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蛋白质的分离纯化方法根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。
使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。
可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。
蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
蛋白质分离和纯化技术的研究和应用蛋白质是生物体内最基本的分子,其担负着细胞结构与功能、物质转运、信号传递等重要生理功能。
由于生物样品中蛋白质种类众多、含量差异较大,为了深入揭示蛋白质的生物学功能和结构特性,必须对蛋白质进行精确分离和纯化。
本文将介绍蛋白质分离和纯化技术的研究和应用。
一、蛋白质分离技术蛋白质分离是指将复杂的蛋白质混合物进行分离,得到不同种类的纯化蛋白质的过程。
在蛋白质分离的基础上,再进行进一步纯化,能够更好地揭示蛋白质的生物学特性。
(一)凝胶电泳凝胶电泳是当前最常用的蛋白质分离技术之一。
它基于蛋白质的电荷、大小、形状和亲疏水性等性质,利用电场将蛋白质分子沿着凝胶移动,实现分子大小的分离。
凝胶电泳具有分离效果好、操作简单易行、样品消耗量小以及可视化等优点。
(二)液相色谱液相色谱(Liquid chromatography)是一种通过化学亲和性、分子大小、极性与非极性等属性分离物质的分离技术。
常用的液相色谱有透析液相色谱、醚基、硅烷基、反相、离子交换、凝胶过滤等类型。
其中反相色谱在蛋白质分离中尤为重要,它基于不同蛋白质在疏水性基质表面的分配系数不同,以蛋白质的亲水性为基础进行分离。
二、蛋白质纯化技术蛋白质纯化是指在获得蛋白质的基础上,通过不同的纯化技术去除其中的杂质,得到纯度高的蛋白质分子。
蛋白质的纯化技术主要分为两类:非特异性纯化和特异性纯化。
(一)非特异性纯化非特异性纯化是指利用物理化学性质对样品进行分步纯化,将目标分子与混杂物质逐步分离开来的方法。
常用的非特异性纯化技术有盐析、凝胶过滤和透析等。
其中,盐析技术是常用的一种非特异性纯化技术,它利用富集目标蛋白质对盐的结合能力高于混杂蛋白质的特性,将混杂蛋白质和目标蛋白质分离。
(二)特异性纯化特异性纯化是指通过蛋白质与配体、抗体等生物学活性团之间的特异作用进行分离纯化的方法。
常用的特异性纯化技术包括亲和层析、免疫亲和层析等。
其中,亲和层析是一种重要的特异性纯化技术,它通过识别目标蛋白质与固定于固相材料上的亲和基团之间的特异性互作来分离纯化蛋白质。
蛋白质的分离和纯化的方法
蛋白质分离纯化常用方法有:
1、沉淀;
2、电泳:蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的,在电场中能向电场的正极或负极移动。
根据支撑物不同,有薄膜电泳、凝胶电泳等。
3、透析:利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
4、层析:
a.离子交换层析,利用蛋白质的两性游离性质,在某一特定PH时,各蛋白质的电荷量及性质不同,故可以通过离子交换层析得以分离。
如阴离子交换层析,含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来f
b.分子筛,又称凝胶过滤。
小分子蛋白质进入孔内,滞留时间长,大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。
5、超速离心:既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。
不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
分离纯化蛋白质的方法及原理
蛋白质纯化是生物分子的一项重要技术,它是分子生物学的核心技术之一,也是蛋白质结构及功能的研究的基础。
它可以从生物样本中分离出蛋白质,研究其结构、性质、功能及相关特性。
根据蛋白质纯化的原理和方法,可以分为物理法、化学法和生物学法等。
1.物理法
物理法是纯化蛋白的最简单方法之一,通常通过使用力场或温度去把一定浓度的蛋白质从溶质中萃取出来。
物理法不耗费能量也不会改变蛋白质的化学结构,不改变蛋白质的结构和功能,但有时可能会引发蛋白质的活性降低,因为櫛发性和相互之间复合物的结合可能会受到改变。
例如分子筛膜技术、沉淀离心技术等。
2.化学法
化学法是一种可以改变蛋白质结构的方法,一般是通过有机溶剂或水溶性固定相,以水或有机溶剂和化学试剂实现蛋白质的分离和纯化。
化学法可以破坏蛋白质的活性,从而改变其化学结构和功能,或者通过改变蛋白质的电性或物理状态来实现蛋白质的分离和纯化。
例如偏光技术、电泳技术、蛋白质酶剪切技术等。
3.生物学法
生物学法是一种比较复杂的蛋白质分离方法,是利用特定生物因子。