4-2 免疫血清制备及效价测定-4

抗原与免疫血清的制备××××××××××抗体是机体接受抗原刺激后产生的一种具有免疫特异性的球蛋白。

在免疫学实践中，为制备抗体常以抗原性物质（细菌、病毒、类毒素、血清及其他蛋白质）给动物注射。

经过一定时间后，动物血清中可以产生大量的特异性抗体。

这种含有特异性抗体的血清称为免疫血清或者抗血清。

免疫血清的制备是一项常用的免疫学技术，高效价，高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用[1]。

免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。

如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。

而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。

免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。

因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。

此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。

在本实验中采用ELISA法和凝集反应的原理来测定免疫血清的效价：ELISA测定的原理是利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。

在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。

根据颜色的深、浅、可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。

该方法可对待检样品进行定性和定量分析；同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。

凝集反应是一种经典的抗原抗体反应，也是高等医学院校学生免疫学实验的重要内容之一，它是指可溶性抗原及其相应抗体在一定条件下出现肉眼可见的沉淀物的现象[2]。

凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类。

前者可利用已知抗血清鉴定未知细菌，优点是极端快速，为诊断肠道传染病时鉴定病人标本中肠道细菌的重要手段；后者是一种定量法，现已发展成微量滴定凝集法，它可利用已知抗原测定人体内抗体的水平(效价)，也是诊断肠道传染病的重要方法。

汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗候选毒种筛选(一)【摘要】目的将肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株适应于Vero细胞，并对其抗原性和免疫原性进行研究。

方法将新分离的4株汉坦病毒接种敏感动物，在乳沙鼠脑内连续传代，比较脑内病毒抗原的含量以及乳鼠的发病情况；在Vero细胞中传代，比较培养液中的病毒滴度和抗原滴度以及细胞的病变情况；利用筛选出的毒株研制Vero细胞灭活疫苗，研究疫苗的免疫原性。

结果4株病毒经乳沙鼠脑内传代，鼠脑悬液的病毒滴度和抗原滴度分别达7 00～7 75LgCCID50/ml和1∶320～1∶1280；4株毒株经Vero细胞连续传5代，培养液病毒滴度和抗原滴度分别达6 50～7 50LgCID50/ml和1∶160～1∶768；疫苗免疫家兔2针后，其中出血热病毒株ZJ4与ZJ5株疫苗免疫血清对同型毒株的中和效价达到1∶10。

结论ZJ4与ZJ5两毒株已适应于Vero细胞，且具有病毒滴度高和免疫原性良好的特性，适合用作Vero 细胞肾综合征出血热疫苗理想的候选毒株。

【关键词】汉坦病毒肾综合征出血热(HFRS)是一种严重危害人体健康的自然疫源性疾病。

在各种预防HFRS的措施中，疫苗是一种最特异和最有效的预防手段。

迄今为止，本实验室已经研究出HFRSⅠ型、Ⅱ型和双价及双价纯化沙鼠肾灭活疫苗并已投入规模生产。

经现场流行病学调查，疫区人群的保护率在95%以上，为预防HFRS起到了重要的作用〔1，2〕。

但疫苗的毒种Z10野鼠型(HTN)和Z37家鼠型(SEO)均为20世纪80年代分离，距今已将近20年，随着时间的推移，HFRS 的流行及临床症状有较大的变化，这预示着引起该病的病毒有可能发生变异。

因此，必须选择疫苗的后备毒株，一旦发生目前疫苗保护率不高或不能保护时，即可用后备毒株生产疫苗。

2001～2002年，我们从浙江省的HFRS疫区鼠肺中分离到了9株汉坦病毒，筛选出病毒滴度较高、抗原性较好的4株毒株〔3〕，再将4株毒株在Vero细胞中的增殖特性、抗原性和免疫原性进行研究，从中筛选出ZJ4与ZJ5毒株为汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗理想的候选毒株。

实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。

结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。

①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。

加酶标抗体进行孵育。

固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。

彻底洗涤未结合的酶标抗体。

此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

加底物反应。

直接法主要用于测定抗原。

②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。

洗涤除去未结合的抗原及杂质。

加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。

经洗涤后，加酶标二抗。

固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。

洗涤后，加底物显色。

③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。

将特异。

免疫血清的制备及效价测定制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。

由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。

制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。

因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。

测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。

第一部分、免疫血清的制备我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG抗体的制备。

Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。

可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。

在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。

【实验材料】1．动物IgG（兔源的，购买）2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物： BALB/c小鼠5．无菌 1ml 注射器6. 生理盐水，酒精棉等【实验步骤】1. 免疫程序：40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。

一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。

2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。

第二部分、免疫血清质量评价一、 效价测定抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法—）、琼脂扩散法1.操作步骤（具体见附注）⑴ 做琼脂板，打梅花孔。

免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。

底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。

结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。

该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。

以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。

除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。

洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。

最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。

传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。

然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。

RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。

但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。

近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。

3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。

竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。

夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。

ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。

4.6 抗体的产生和制备4.6.1 抗体生物合成的一般性和特殊性抗体合成过程1、在DNA转录及mRNA剪接之后，携带遗传信息的mRNA移至粗面内质网上的核糖体，轻链在190-200S小多聚核糖体（含4-5个核糖体）上合成；重链在270-300S大多聚核糖体（含11-18个核糖体）上合成。

2、重链、轻链从粗面内质网进入光滑内质网中，装配为四肽链。

H+L→HL；HL+HL→H2L2 或H+H→H2、L+L→L2；H2+L2→H2L23、装配好的Ig分子进入高尔基体，然后向细胞膜移动，在移动过程中加糖，形成完整的Ig分子后，分泌到细胞外。

抗体的生物合成过程4.6.2 抗体产生多样性的分子生物学基础日本科学家利根川进在20世纪70年代阐明了免疫球蛋白的基因结构，证实了其基因的重排和突变是抗体多样性的原因，使免疫球蛋白多样性的遗传控制找到了依据。

1987年获得诺贝尔生理和医学奖。

免疫球蛋白基因定位人的Ig的基因组成κ链：Vκ(约100个)、 Jκ(5个)、 Cκ(1个)λ链：Vλ(约30个)、 Jλ-Cλ(4个) H链：V基因(约95个)D基因(27个)J基因(6个)C基因(9个)轻链基因的重排重链基因的重排先重组的 V H D H J H基因片段可在不同的C H基因之间转换，使 B 细胞经过同一抗原刺激后合成具有不同 C 区的各种类别 Ig，并可介导不同的效应功能。

Ig的类别转换（class switching）B 细胞最初表达 IgM 和/或 IgD，然后 DNA 进一步重组。

一个B细胞克隆在分化过程中V-D-J功能性基因片段保持不变，而发生C基因重排，使其表达的抗体分子发生H链类的改变，称为类别转换。

B细胞克隆→ IgM →抗体类别转换抗体产生多样性的途径人免疫球蛋白各组成成分的多样性估量基因片段重链轻链( 组合) H κλV基因 100-1,000 100 10 D基因 20 0 0 J基因 6 5 6 V ×J(×D)基因 12,000-120,000 500 60重链－轻链组合H×κ 6×106-6×107H×λ 7.2×105-7.2×1062、重组基因连接的多样性D H -J H 、VH -DH 、JH和V L、J L的交接处出现的连接方式不够明确D region T GG C C C Pro Trp C C C C C C V geneT G G D region C C C C C C V gene T GG C G G C C C Pro ArgC C C C C C V geneT GG D region C GC C C C Pro Pro密码子内发生的连接位置的多样性由于连接方式不明确，导致读码框架移动CAG C CG GAT CAGCAGCGATCAG-GTCAATG-GTCAATG -+Break DNAN region insertionIntron J D J J J DD D N 区 核 苷 酸 插 入（V D J 衔接点的插入方式之一）3、体细胞基因突变只改变VJ或VDJ单个片段的个别核苷酸二、在蛋白质水平上：由轻链和重链的随机选择和配对引起4.6.3 抗体产生的一般规律抗体产生的一般规律4.6.4 抗体产生的机理4.6.4.1模板学说（诱导学说，t e m p l a t e theory）2、间接模板学说：4.6.4.2 选择学说（selective theory ）自然选择学说→克隆选择学说（c l o n a lselective theory ）（无性繁殖系选择学说或细胞选择学说）克隆选择学说基本论点（基本要点）克隆选择学说的证据n通过动物模型实验：n选择性的去除某细胞株后，再经相应抗原剌激而不能发生相应免疫反应：抗原A剌激而不能发生相应免疫反应，克隆选择学说亚细胞选择学说从分子水平上解释克隆选择学说（无性繁殖系选择学说）：4.6.5 影响抗体生成的因素4.6.5.1 机体的免疫功能1）、遗传因素（应答者）A、种类的影响：肺炎球菌多糖 →小鼠→有反应肺炎球菌多糖 →豚鼠→无反应艾滋病毒→某些人类→有反应艾滋病毒→非洲绿猴→无反应B、品系的影响：多聚L赖氨酸→豚鼠2系→有反应多聚L赖氨酸→豚鼠13系→无反应C、个体免疫差异艾滋病毒→一部分人→有反应艾滋病毒→另一部分人→无反应如肯尼亚“买春女“→无反应n 2）、生理因素：年龄、营养、健康状况和激素水平（神经与内分泌系统对免疫功能的影响）。

实验报告实验名称多克隆抗体的制备一（抗血清制备）实验日期院系专业班级姓名学号一、实验目的了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术。

二、实验器材试剂：酒精棉球、NDV灭活油乳剂疫苗、麻醉剂器材：兔笼、注射器、剃毛剪、手术刀、止血钳、手术剪（组织剪、眼科剪）、动脉夹、眼科剪、动脉导管、纱布、棉线、细线、培养箱、冰箱、结扎细线、离心机、温箱三、实验原理1.机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产体液免疫和细胞免疫的过程。

一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构——抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。

2.将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。

抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。

抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。

待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。

3.由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体。

4.多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。

对于免疫原性较弱的可溶性抗原（如蛋白质类抗原）要加入佐剂，以增强免疫性。

3. 放37度温箱温浴，是为了让血液内纤维蛋白原收缩，降低血清和红细胞的粘连，从而使使血清更容易与红细胞分离，不易产生溶血现象。

4. 在4℃冰箱内放置使血清析出，低温有利于稳定抗体等蛋白质的结构，防止其变性而丧失功能。

免疫学实验抗血清的制备及其效价测定班级：生物技术1401小组：11姓名：2016年11月抗血清的制备及免疫小鼠效价检测摘要：本试验以牛血清白蛋白为抗原，对小鼠和家兔进行免疫，以制备高效价抗血清。

采用多次中程免疫使产生免疫应答小鼠的血清中抗体达到实验所需的要求，然后采集小鼠血液，从中分离出血清，从而获得抗血清。

利用间接ELISA 方法测得抗血清效价。

关键词：抗血清；间接法ELISA ；抗体效价前言：用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。

抗体主要存在于血清中，经三次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。

酶联免疫吸附实验（ELISA ）是一种新型的免疫测定技术，利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加相应的二抗，生成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。

材料与方法：实验主线：实验材料：包被缓冲液（0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液）、10ug/ml 抗原（牛血清白蛋白）、0.01M PBS 溶液、5%（w/v ）脱脂奶粉、PBST 洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01M 的PBS ）、2M H2SO4、待测抗体、HRP 标记的羊抗小鼠IgG （二抗）、底物溶液TMB 、健康小鼠酶标板、酶标仪、保鲜膜、排枪、离心管、玻璃棒、烧杯、离心机、恒温箱动物免疫抗血清的采集与分离中程免疫3次间隔一周间接法ELISA 测定抗血清的效多克隆抗体实验内容与方法：一．动物的免疫：1.1实验动物的选择选择实验动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。

选择与抗原亲缘关系远的动物，尤其在制备抗免疫球蛋白（Ig）抗体时；根据抗体的需要量选择动物，制备一抗常用动物为小鼠和家兔，制备二抗常用动物为羊和马；常用青壮年期的雄性动物。