琼脂糖凝胶的配制

琼脂糖凝胶的主要成分琼脂糖凝胶是一种常见的实验室材料，它具有良好的凝胶性能和化学稳定性，因此被广泛应用于分离、纯化、检测和分析生物分子。

琼脂糖凝胶的主要成分是什么？这是本文要探讨的问题。

一、琼脂糖的来源和性质琼脂糖是一种天然的多糖物质，主要来源于海藻和昆虫的外壳。

它是一种无色或微黄色的透明胶状物，具有良好的水溶性和凝胶性。

琼脂糖的化学结构是由多个半乳糖和葡萄糖单元组成的线性聚合物，它们之间通过1-3和1-4的糖苷键连接在一起。

琼脂糖的分子量较大，通常在10000到1000000之间。

二、琼脂糖凝胶的制备方法琼脂糖凝胶是通过加热琼脂糖溶液使其溶解，然后冷却凝胶化得到的。

具体操作方法如下：1.称取适量的琼脂糖，加入适量的缓冲液中，加热搅拌使其溶解。

2.将琼脂糖溶液倒入培养皿中，冷却凝胶化。

3.将凝胶切成所需的形状和大小，可以用于各种生物学实验。

三、琼脂糖凝胶的主要成分琼脂糖凝胶的主要成分是琼脂糖。

此外，还含有一些缓冲液和添加剂，以调节凝胶的性质和稳定性。

常用的缓冲液有Tris、HEPES、MES等，它们可以调节凝胶的pH值和离子强度。

添加剂包括硼酸、EDTA、Tween-20等，它们可以增强凝胶的稳定性和凝胶性能。

四、琼脂糖凝胶的应用琼脂糖凝胶具有良好的凝胶性能和化学稳定性，因此被广泛应用于分离、纯化、检测和分析生物分子。

它可以用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的电泳分离和检测，也可以用于细胞和细胞器的分离和纯化。

此外，琼脂糖凝胶还可以用于制备凝胶柱、凝胶片和凝胶微球等实验室材料。

五、琼脂糖凝胶的优缺点琼脂糖凝胶具有以下优点：1.凝胶性能好，能够有效地分离和纯化生物分子。

2.化学稳定性好，不易受到外界环境的影响。

3.易于制备和使用，成本较低。

但是，琼脂糖凝胶也存在一些缺点：1.分辨率不高，不能有效地分离和检测分子之间的微小差异。

2.凝胶性能受到温度、pH值和离子强度等因素的影响，需要进行严格的控制。

制作琼脂糖凝胶的步骤
嘿，朋友们！今天咱来唠唠制作琼脂糖凝胶的那些事儿。

你可别小瞧这琼脂糖凝胶，它就像是一个神奇的舞台，能让各种分子在上面尽情表演呢！
首先，咱得准备好材料呀，琼脂糖那肯定是主角啦，还有电泳缓冲液，就像给演员准备的合适氛围一样。

然后呢，把琼脂糖称好重量，放进锥形瓶里。

这就好比给演员搭好了舞台架子。

接着加上适量的电泳缓冲液，就像是给舞台布置好了灯光和音效。

接下来，把锥形瓶放在微波炉里加热，让琼脂糖彻底融化。

这时候啊，就好像舞台上的灯光开始闪烁，气氛热烈起来啦。

等琼脂糖完全融化成透明的液体，哇哦，那可真是神奇的一刻。

趁热赶紧把这液体倒进模具里，这就像是让演员赶紧上台表演啦。

倒的时候可得小心点，别弄得到处都是。

倒好后，把模具放在水平的地方，让它慢慢冷却凝固。

这等待的过程就像是幕布缓缓拉起，精彩即将呈现。

等它凝固好了，一块完美的琼脂糖凝胶就诞生啦！就像舞台搭建成功，演员们可以开始尽情展现自己啦！
你想想，在这个凝胶上，各种分子会按照它们的特性跑来跑去，多
有意思呀！
哎呀，制作琼脂糖凝胶是不是挺简单的，但每一步可都不能马虎哟！要是哪个环节出了差错，那可就像舞台上出了状况，表演可就不完美啦。

所以啊，大家在制作的时候一定要细心细心再细心，就像呵护珍贵
的宝贝一样。

这样制作出来的琼脂糖凝胶才能发挥它最大的作用呀！
怎么样，听我这么一说，是不是觉得制作琼脂糖凝胶也没那么难啦？赶紧去试试吧！。

琼脂糖凝胶法琼脂糖凝胶法是一种常见的生物学分离和纯化技术，通常用于分离蛋白质、核酸等生物大分子。

本文将详细介绍琼脂糖凝胶法的原理、步骤、优缺点及应用。

一、琼脂糖凝胶法的原理琼脂糖凝胶法利用琼脂糖为基质制成凝胶，生物大分子在凝胶中按照大小形状等物理化学特性进行分离。

具体来说，琼脂糖凝胶法通过静电吸附和筛分作用，将生物大分子分离出来。

其中，静电吸附指分子与凝胶间的两种相互作用，即极性作用和疏水作用，从而形成复杂的蛋白质凝胶；筛分作用指由于凝胶的孔径大小不同，使分子以不同的速率通过凝胶，从而分离出不同大小的分子。

二、琼脂糖凝胶法的步骤1. 准备琼脂糖凝胶：将琼脂糖与缓冲液混合，加热至琼脂糖完全溶解，然后冷却凝固成凝胶。

2. 加载样品：将待分离的样品溶解在缓冲液中，加在凝胶上。

3. 电泳：将凝胶放在膜上，样品与电极相连接，通电使蛋白质、核酸等生物大分子向电极移动。

4. 取样：电泳结束后，将凝胶切割出感兴趣的区域，取出样品作进一步分析。

三、琼脂糖凝胶法的优缺点1. 优点：琼脂糖凝胶法分离速度快，分离效果明显，平稳可靠，适用于分离不同大小的生物大分子，具有较好的灵敏度和特异性。

2. 缺点：琼脂糖凝胶法分离准确性较低，受制于分子量、电荷等因素的复杂性，分离时易产生假阳性或假阴性等问题；此外，琼脂糖本身易受菌污染或批号不一致等因素的影响，从而影响凝胶质量等问题。

四、琼脂糖凝胶法的应用琼脂糖凝胶法广泛用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离和纯化，特别适用于分离蛋白质，如分离血清蛋白、抗体、酶、激素等。

此外，琼脂糖凝胶法还可以用于生物分子的筛选、活性和空间结构的研究、药物筛选等领域。

总之，琼脂糖凝胶法是一种优秀的生物学分离和纯化技术，具有广泛的应用前景和研究价值。

琼脂糖凝胶电泳步骤实验前准备及注意事项：将所要用到的制胶锥形瓶、胶槽、梳齿等物品清理干净，如有残胶，需将残胶尽量去除。

注意：所有用来跑核酸胶的物品，只要接触过核酸染料，一定要专门放置，专物专用，不要再将污染过的物品随意放置，以免污染其他物品。

接触过核酸染料的手套不要再碰非污染区的物品。

制胶和拿取核酸胶时佩戴一次性PE手套，再操作其他地方时将一次性手套丢弃。

实验步骤：1.按每100ml 1×TAE/TBE缓冲液中加入1g琼脂糖（1%的胶，根据核酸大小选择制胶的浓度，一般情况用1%-2%的胶）的比例，称取琼脂糖，加入专门制琼脂糖凝胶的250ml-500ml的锥形瓶中。

2.按比例量取适量的1×TAE/TBE缓冲液，加入到锥形瓶中的琼脂糖一起，适当摇晃锥形瓶初步混匀。

3.将混合液放入微波炉中，用中高火加热，加热总时间可根据制胶总量调整，一般40ml左右的胶量加热90s左右。

如果制胶量大，记得每加热1min左右将瓶从微波炉中取出，轻轻晃匀后，再继续加热，以免局部过热导致胶溢出。

注意：取出加热后的瓶时，记得垫上纸，防止烫手！4.待胶加热好，完全溶解后，稍晾凉至45-55℃左右（以基本不太烫手为宜）按照1:10000的比例加入核酸染料（如100ml胶加10ul染料），迅速摇匀。

5.将胶槽和梳齿准备好，梳齿可以预先插好，将上一步摇匀的胶倒入胶槽中，一般厚度以60mm左右为宜，具体要根据梳齿的厚度以及样品量来定。

6.待胶变白，基本表示胶已凝好，此时可以将梳齿拔出，一定要竖着往上拔梳齿，不要摇晃，以免样品孔被破坏。

7.在电泳槽中倒入1×TAE/TBE缓冲液，将制好的胶放入缓冲液，以缓冲液没过样品孔为宜。

8.点样：根据样品孔的大小决定上样量，每一排样品孔至少有一个孔用来点DNA Marker。

（上样前确定每个样品和Marker里都已经加了Loading buffer，Loading buffer 的终浓度为1×）9.确定样品孔的方向，核酸带负电，样品孔要在负极，通电后在胶孔中向正极移动。

琼脂糖凝胶电泳知识：琼脂糖凝胶浓度（%）线状DNA分子分离范围（kb）0.3 5--600.6 1--200.9 0.5--71.2 0.4--61.5 0.2--32.0 0.1--2试剂及配制：50×TAE缓冲液:2 mol/L Tris-乙酸, 0.05 mol/L EDTA(pH 8.0)。

配制1000 ml 50×TAE缓冲液方法：Tris 242 g，冰乙酸57.1 ml，0.5 mol/L EDTA 100 ml，加入600 ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.调pH 8.0，高温高压灭菌,4℃保存.1×TAE缓冲液的配制:量取20 ml的50×TAE缓冲液,再加入980 ml的去离子水.5×TBE缓冲液（Tris-硼酸）: 配制1000 ml 5×TBE缓冲液方法：Tris 54 g，27.5g硼酸，20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)。

加去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.调pH 8.0，高温高压灭菌,4℃保存.溴化乙啶贮存液:10 mg/ml 溴化乙啶。

配制100 ml溴化乙啶贮存液方法：称取1 g溴化乙啶,置于100 ml烧杯中,加入80 ml去离子水后搅拌溶解.将溶液定容至100 ml后,转移到棕色瓶中.室温保存.。

6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油（或40%蔗糖）。

配制10 ml 6×上样缓冲液方法：溴酚蓝25 mg二甲苯青FF 25 mg，甘油 3 ml，用6×TAE缓冲液定溶至10 ml,分装成1 ml/管.-20℃保存.琼脂糖凝胶电泳操作步骤：1). 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.2). 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3). 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).4). 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.常见问题及注意事项：1.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶.2.琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓.3.电泳时应注意电源线路,预防触电.4.溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套.并在专门的实验室内使用.5.紫外线对人体有损伤作用,开灯时间不宜太长,注意防护.6.DNA带形状模糊NA加样过多;电压太高;凝胶中有气泡.7.质粒DNA的存在形式有3种,①共价闭环DNA(cccDNA),常以超螺旋形式存在;②开环DNA(ocDNA),此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂,因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子;③线状DNA,因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带,它们的泳动速度为:cccDNA > 线状DNA > ocDNA. 添加来自TIANGEN的资料:1,琼脂糖:不同厂家＼不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同,影响DNA的迁移及其荧光背景的强度,应有选择的使用.2,凝胶的制备:凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致,溶化的凝胶应该及时倒入板中,避免倒入之前凝固结块,倒入板中的凝胶应该避免出现气泡,以免影响电泳结果.3,电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和PH,应经常更新电泳缓冲液.4,样品加入量:一般情况下,0.5CM宽的梳子可加0.5微克的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片断的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清楚;反之,则应该适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾或扩散,对于较大的DNA此现象更明显.5,DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品中应该使用同样的缓冲条件以消除这种影响.6,DNA迁移率取决于琼脂糖的浓度,迁移分子的形状及其大小.采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度.小片断DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,以提高分辨率.。

琼脂糖凝胶电泳缓冲液的配制附录5:琼脂糖凝胶电泳缓冲液的配制有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳。

它们包括Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液(pH8.0，TAE，也称作E缓冲液)、Tris-硼酸盐缓冲液(TBE)或Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)，工作液浓度约50nm0l/L，工作pH7.5-7.8。

各种电泳缓冲液通常配制成浓溶液存放(表5-3)。

表5-3 电泳缓冲液缓冲液工作液贮存液/LTAE 1 × 50 ×40 mmol/L Tris-乙酸盐 242 g Tris;37.2g NaEDTA.2HO; 221 mmol/L EDTA 搅拌溶解;57.1 ml冰乙酸;充分搅拌后定容至1000 ml。

TPE 1× 10 ×90 mmol/L Tris-磷酸盐 108 g Tris2 mmol/L EDTA 15.5 ml磷酸(85%，1.679)40 ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)TBE* 0.5 × 5 ×45 mmol/L Tris-硼酸盐 54 g Tris; 3.72g NaEDTA.2HO; 221 mmol/L EDTA 27.5 g硼酸;充分搅拌溶解后定容至1000ml。

* TBE通常作为5×或10×的贮存液配制和贮存。

这种浓的贮存液pH应为8.3左右，它在应用前稀释，并用同一种贮存液制备凝胶溶液和电泳缓冲液。

有些研究者习惯用更浓的TBE贮存液，如10×的。

但是5×的贮存液更稳定，因为贮存期间溶质不沉淀。

上述三种缓冲液都工作得很好。

三者之中TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗。

此时的凝胶的阳性一侧将发生酸性化，凝胶中向阳极迁移的溴酚蓝的顔色呈从蓝紫色到黄色的变化，故需定期更换缓冲液。

琼脂糖电泳技术一、琼脂糖凝胶电泳可以：〔1〕用于DNA切胶回收；〔2〕用于DNA别离；〔3〕用于佐证DNA是否重组、质粒等是否切开以及其他分子生物学研究。

二、DNA分子量标准的制备采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。

λDNA为长度约50kb的双链DNA分子，其商品溶液浓度为0.5mg/ml，酶解反应操作如上述。

HindIII切割DNA后得到8个片段，长度分别为23.1，9.4，6.6，4.4，2.3，2.0，0.56和0.12kb。

EcoRI切割lDNA后得到6个片段，长度分别为21.2，7.4，5.8，5.6，4.9和2.5kb。

三、琼脂糖凝胶的制备1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。

2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。

加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。

加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。

3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。

将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。

向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。

用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。

倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。

待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5×TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上外表。

实验名称：DNA琼脂糖凝胶电泳实验日期：2023年10月25日实验目的：1. 学习并掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作步骤。

2. 通过电泳分离不同分子量的DNA片段，观察并分析实验结果。

3. 了解DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移规律，并探讨影响迁移速度的因素。

实验原理：DNA琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学技术，用于分离、鉴定和定量DNA片段。

DNA分子在电场中带有负电荷，在琼脂糖凝胶的筛分作用下，根据分子大小和构型不同，迁移速度不同，从而实现分离。

溴化乙锭（EB）作为一种荧光染料，可以嵌入DNA分子中，在紫外光照射下发出橙红色荧光，便于观察DNA片段的位置和大小。

实验材料与仪器：- 仪器：电泳仪、紫外检测仪、水平电泳槽、移液器、一次性手套等。

- 试剂：琼脂糖、EB溶液、Tris-硼酸-EDTA缓冲液、加样缓冲液等。

- 材料：分子量不同的DNA片段。

实验步骤：1. 琼脂糖凝胶的制备：- 称取1g琼脂糖，加入10ml电泳缓冲液，再加入90ml蒸馏水，在电炉上加热溶解，配制成1%琼脂糖凝胶。

- 待凝胶冷却至60-70℃时，加入数滴EB溶液，混匀。

2. DNA样品的制备：- 将DNA片段用Tris-硼酸-EDTA缓冲液稀释至适当浓度。

3. 加样：- 将制备好的琼脂糖凝胶倒入电泳槽中，插入电泳梳子。

- 使用移液器将DNA样品加至凝胶孔中。

4. 电泳：- 将电泳槽放入电泳仪中，设定合适的电压和时间进行电泳。

5. 观察与分析：- 电泳完成后，取出凝胶，用紫外检测仪观察DNA片段的迁移情况。

- 比较不同分子量DNA片段的迁移速度，分析实验结果。

实验结果：- 通过电泳观察到，不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶中迁移速度不同，分子量越小，迁移速度越快。

- EB染料嵌入DNA分子后，在紫外光照射下呈现橙红色荧光，便于观察DNA片段的位置和大小。

讨论：1. 影响DNA分子迁移速度的因素主要有：分子大小、构型、电场强度、凝胶浓度等。

琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像分析琼脂糖凝胶电泳的原理是利用琼脂糖凝胶的孔隙结构对样品进行分离。

琼脂糖分子是一种聚糖，可以形成凝胶状的结构。

当样品被加入凝胶槽中，通过电泳移动，根据其大小和电荷性质在凝胶中移动的速度不同，从而实现分离。

实验步骤如下：1.准备琼脂糖凝胶：根据需要选择凝胶浓度，一般常用的是1%琼脂糖凝胶。

将适量的琼脂糖加入缓冲溶液中，加热搅拌溶解后，倒入平板或垂直电泳槽中，在适当的时间内形成凝胶。

2.配制样品：将待分析的核酸或蛋白质样品与加载缓冲溶液混合，加热变性处理，使其呈现线性的构象。

3.加载样品：将样品缓冲溶液缓缓注入琼脂糖凝胶槽中的孔隙中，待样品进入凝胶中后，断开电源，继续加入样品溶液。

4.电泳操作：连接电源，设置电场方向和电压大小，运行一段时间。

根据样品性质和需要，可以选择水平电泳或垂直电泳。

水平电泳适用于核酸分析，而垂直电泳适用于蛋白质分析。

5.凝胶染色：分离结束后，将凝胶转移到染色剂中，染色一段时间。

6.凝胶成像：将染色后的凝胶放在成像仪中进行成像。

通常可以使用紫外线照射凝胶，凝胶中的核酸或蛋白质会发生荧光，可以通过成像仪观察到凝胶中的带状图。

凝胶成像分析是对电泳结果进行定性和定量分析的方法。

一般可以根据带状图的位置、形状和强度等特征来判断样品的分离效果。

通过分析带状图，可以确定样品的大小、纯度和相对定量等信息。

总结起来，琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像分析是一种常用的核酸或蛋白质分析方法。

通过合理的操作步骤，可以对样品进行有效的分离和分析，为生物学研究提供重要的实验手段。