琼脂糖凝胶的制备上课讲义

琼脂糖凝胶什么是琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是一种由琼脂素制成的凝胶状物质，具有较好的凝胶性能。

它是一种常见的实验室试剂，广泛用于分离、纯化和分析生物大分子如蛋白质、核酸和多糖等。

琼脂糖凝胶的制备方法材料•琼脂素（Agarose）•缓冲溶液步骤1.准备含有适量琼脂素的缓冲溶液，通常使用Tris缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液。

2.将缓冲溶液中的琼脂素加热至溶解，可以使用烧杯和加热板完成这一步骤。

3.琼脂素完全溶解后，将溶液倒入矩形或圆形的琼脂糖凝胶模具中。

4.等待琼脂糖凝胶冷却和凝胶化。

凝胶的结构可以通过调整琼脂素的浓度和凝胶化温度来进行控制，常见的琼脂糖凝胶浓度为0.5%-2.0%。

琼脂糖凝胶的应用琼脂糖凝胶在生物科学领域有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 蛋白质凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常见的蛋白质分离技术。

凝胶中的孔隙结构可以根据蛋白质分子的大小、形状和电荷特性，实现对蛋白质的分离和纯化。

通过电泳电场的作用，蛋白质分子会迁移至电泳胶中，形成一系列条带，可以根据条带的位置和宽度来判断样品中蛋白质的相对含量和纯度。

2. 核酸凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳也被广泛应用于核酸分析和分离。

琼脂糖凝胶可以在电场中对核酸进行分子大小分离，并可通过DNA染料或放射性标记物对核酸进行可视化。

这种技术可以用于DNA片段的分离、纯化和定量分析，也可以用于RNA的分离和检测等。

3. 蛋白-核酸相互作用研究琼脂糖凝胶亦可用于研究蛋白与核酸之间的相互作用。

通过在琼脂糖凝胶中添加核酸和蛋白质样品，可以观察它们之间的相互作用。

这种方法可以用于研究蛋白与DNA或RNA之间的结合，还可以用于筛选与特定核酸序列结合的蛋白。

4. 免疫固定电泳琼脂糖凝胶亦可用于免疫固定电泳，用于研究蛋白质的抗原性质。

在这种方法中，将抗原与琼脂糖凝胶混合，使其固定在凝胶孔隙中，然后通过电泳将抗原从凝胶中迁移出来。

迁移过程中，抗原与抗体之间的特异性结合会引起凝胶中条带的出现，可以用于确定蛋白质的抗原性质。

琼脂糖凝胶制备方法嘿，朋友们！今天咱就来唠唠琼脂糖凝胶制备这档子事儿。

你可别小瞧这琼脂糖凝胶，它在好多实验里那可是大功臣呢！就好像是一个魔法盒子，能把各种分子按照我们的意愿分离开来。

首先呢，得准备好材料。

琼脂糖，这可是主角儿，就像做饭得有米一样。

还有电泳缓冲液，这就好比是给主角搭戏的配角，少了它可不行。

然后就是动手操作啦！先把琼脂糖称好重量，小心翼翼地放到锥形瓶里。

哎呀，这时候可不能马虎，多一点少一点都会影响效果的。

接着，加入适量的电泳缓冲液，就像给主角泡个舒服的澡。

之后呢，把锥形瓶放到微波炉里加热。

嘿，这就像是给它们来个高温桑拿，让琼脂糖彻底融化。

加热的时候可得盯着点，别加热过头了，不然可就糟糕啦！等琼脂糖完全融化后，稍微晾凉一会儿，可别烫着自己的手呀。

接着，就是把融化的琼脂糖溶液倒进模具里啦。

这就像是给蛋糕倒面糊一样，得均匀倒进去，不能一边厚一边薄的。

倒完后，让它自然冷却凝固，这时候就耐心等等吧，就像等花儿开放一样。

等凝胶凝固好了，就可以把它从模具里取出来啦。

哇，这时候看着自己亲手做的琼脂糖凝胶，是不是很有成就感呢？在这个过程中，每一步都很关键呀！就像盖房子，一块砖没砌好可能房子就不牢固。

咱做琼脂糖凝胶也是一样，每一个细节都得注意到。

要是有一步出了差错，那可能整个实验就没法顺利进行啦。

你说这琼脂糖凝胶制备是不是很有意思？虽然过程不复杂，但是需要我们的细心和耐心呀。

想想看，通过我们的努力，做出了一块完美的琼脂糖凝胶，能为实验提供有力的支持，这感觉多棒呀！所以呀，大家别害怕尝试，大胆地去做，就一定能成功的。

就像那句话说的，世上无难事，只怕有心人嘛！加油哦，朋友们！让我们一起在琼脂糖凝胶制备的道路上越走越远，为科学实验贡献我们的力量！。

实验二-琼脂糖凝胶电泳实验实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；（3）学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。

【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。

核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。

核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。

因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：（1）DNA的分子大小。

线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。

（2）DNA分子的构象。

当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。

相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。

如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。

（3）电源电压。

在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。

但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。

要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。

（4）离子强度影响。

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。

在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

t-PA基因的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验讲义一、实验目的1.掌握PCR反应的原理和方法；2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定DNA的原理和方法。

二、实验原理PCR原理: 首先使双链DNA在反应液中热变性而分开成单链, 然后在低温下与两个引物进行退火。

使引物与单链DNA配对结合, 再在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合反应。

每经过一次变性, 退火, 延伸三个步骤为一个循环, 通过三个不同温度的重复循环, 在经过约30次后, 所扩增的特定DNA序列的数量可增至10000000倍, 由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板, 所以在这周而复始的过程中每完成一个循环, 就基本上使目的DNA物增加一倍。

变性（denaturation）: 双链DNA在92－96℃变性成单链DNA。

退火（annealing）: 引物在45-72℃与模板的互补区域相结合。

延伸（extension）: 在72℃条件下DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3’-OH端, DNA 链的延伸方向为5’-3’。

DNA琼脂糖凝胶电泳原理：DNA分子在碱性环境中带负电荷, 外加电场用下, 向正极泳动。

不同的DNA片段由于其由荷、分子量大小及构型的不同, 在电泳时的泳动速率就不同, 从而可以区分出不同的区带, 电泳后经溴乙锭（EB）染色；在波长254nm紫外光照射下, DNA呈现橙红色荧光。

琼脂糖凝胶电泳所需 DNA样品量仅为 0.5-0.1μg, 溴乙锭检测 DNA, 灵敏度很高, 10mg 或更少的DNA即可检出。

三、实验仪器超净工作台、回转式恒温调连摇瓶机、培养箱、冰箱、深冷冰箱（-70℃）、冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、紫外凝胶成像系统、紫外分光光度计、恒温水浴锅、移液器、微波炉。

四、实验药品蛋白陈、酵母粉、氯化钠、琼脂、氯仿、异戊醇、异丙醇、琼脂糖、饱和酚、氯化苄、CTAB.臭酚蓝、醋酸钠、DL2000Marker、TaqDNA聚合酶、Pfu酶、Dntp、Tris、HCl、Tris-HCl、葡萄糖、NaOH、乙醇、乙酸钾、冰乙酸、蔗糖、ddH2O、EB.EDTA.SDS、引物。

1%琼脂糖凝胶的配制
琼脂糖凝胶是一种由琼脂糖和其他添加剂组成的凝胶，常用于生物学实验中的凝胶电泳等分离技术。

1%琼脂糖凝胶是一种较为常见的浓度，其配制方法如下：
材料与仪器：
- 琼脂糖
- 缓冲液（如TAE或TBE缓冲液）
- 水
- 量筒
- 烧杯
- 搅拌棒
- 电泳槽
- 电泳电源
步骤：
1. 将所需琼脂糖称量并加入烧杯中。

按照1%的浓度，需加入1克琼脂糖。

2. 加入所需缓冲液并充分搅拌，在室温下静置15分钟左右，让琼脂糖充分溶解。

3. 将溶液加热至沸腾，持续搅拌，直至琼脂糖完全溶解。

4. 将溶液冷却至约50℃左右，再加入适量的水调节体积，使其达到所需体积。

一般来说，配制1%琼脂糖凝胶时，需要配制100毫升。

5. 充分搅拌使溶液均匀，然后倒入电泳槽中。

在溶液凝固前，用搅拌棒将表面的气泡排除。

6. 等待凝胶完全固化，即可进行凝胶电泳实验。

注意事项：
1. 在配制过程中，应注意卫生和安全。

避免口吐琼脂糖溶液，避免溶液溅入眼睛等敏感部位。

2. 在加热过程中，应注意溶液是否沸腾过于激烈，避免烫伤或将溶液溅出烧杯。

3. 在调节体积时，应注意准确测量加水量，避免导致浓度错误。

4. 在倒入电泳槽前，应确保凝胶槽干净，避免杂质或细菌污染。

总结：
1%琼脂糖凝胶是一种常见的实验用品，其配制方法简单易行。

在配制过程中，应注意卫生和安全，避免误操作导致事故。

配制完成后，应确保凝胶槽干净，避免影响实验结果。

琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备一、琼脂糖凝胶的特点天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80％）及琼脂胶（agaropectin）组成。

琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。

因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。

1. 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。

2. 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

3. 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。

4. 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。

制成干膜可长期保存。

目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。

将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug蛋白质就可检出。

琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。

由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。

二、DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。

1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系① DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。

但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。

此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。

实验二琼脂糖凝胶的制备一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。

本实验学习DNA琼脂糖凝胶的制备方法二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。

DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。

DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。

不同构型的DNA分子的迁移速度不同。

如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。

这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。

不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。

在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。

影响核酸分子泳动率的因素主要是：1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。

一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。

但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。

对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA 分子长度（bp）的负对数­——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。

DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA＞IDNA＞ocDNA 但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。