第３９卷第５期２０１８年㊀９月水生态学杂志J o u r n a l o fH y d r o e c o l o g yV o l ．３９,N o ．５S e p．㊀２０１８D O I :１０．１５９２８/j．１６７４３０７５．２０１８．０５．０１６㊀㊀收稿日期:２０１７０３１０基金项目:山西省水利推广项目(２１３０３１７).作者简介:张元,１９８３年生,女,工程师,主要从事水产生态养殖技术研究.E Ｇm a i l :２５２２５９５６５＠q q．c o m 池塘养殖水体中土著反硝化细菌的分离与初步鉴定张㊀元(山西省水产育种养殖科学实验中心,山西太原㊀０３０００２)摘要:池塘养殖水体水质恶化问题日益突出,尽管已有各种商品化微生态制剂,但水质净化修复效果始终未得到有效提高.通过采用定向分离㊁筛选㊁扩繁来自原生境的土著有益菌的方法进行生物修复,从而提高养殖废水的净化修复效果;该方法具有针对性强㊁效果佳㊁安全性高㊁成本低以及持续活性时间长㊁无二次污染等优点.２０１６年９月,从山西省运城黄河滩涂水产养殖主产区养殖中后期的池塘水体中定向分离筛选得到１株土著反硝化细菌,命名为Y J Ｇ１,使用奈氏试剂和格利斯试剂对其反硝化能力进行检测.结果显示,奈氏试剂显示黄色,格利斯试剂显示绛红色,说明在细菌培养２４h 后发酵液中产生了少部分的铵离子和较多的亚硝酸盐,菌落具有反硝化功能.经１６S r D N A 序列扩增与测定,片段长度为１４４１b p.无根系统发育树分析显示,Y J Ｇ１与产酸克雷伯氏杆菌(K l e b s i e l l ao x y t o c a )的同源性最高,Y J Ｇ１的分离打破了现有微生态制剂成分大多数为各种商品菌的局势;在水产微生态制剂制备过程中定向加入土著反硝化细菌,可有效降低养殖水体中氨氮与亚硝酸盐含量㊁减少鱼体发病率;反硝化细菌在水产养殖水质净化㊁城市污水处理中具有较大的应用前景,本研究为其他土著有益菌的分离㊁筛选㊁鉴定及应用提供了可借鉴的思路.关键词:池塘;养殖水体;反硝化菌;分离;鉴定中图分类号:Q ９３９．９㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:１６７４３０７５(２０１８)０５０１１１０５㊀㊀自我国推行以养为主 的渔业发展方针以来,淡水池塘养殖业发展迅猛,养殖模式集约化程度逐步提高.然而,养殖者仅为了追求产量和经济效益,忽略了盲目提高放养密度和增加投饵量后造成的水质快速恶化问题.尤其我国大部分养殖池塘的水质维护管理技术相对滞后,养殖动物的排泄物㊁残骸及残饵大量积累,水体中氮磷含量急剧升高,在养殖中后期均达到了富营养化程度(宋超等,２０１２;邓来福和江兴龙,２０１３).水体中藻类生长的规律符合最小因子定律,磷在水体中为不完全循环状态,使得世界上很多地区的水域都严重缺磷,致使磷成为初级生产力的重要限制因素(S t e v e n s o ne t a l ,２０１２).当大量磷进入水体,往往引起浮游植物的迅猛增长使水体呈现富营养化,水体溶解氧含量下降,氨氮㊁亚硝酸盐㊁硫化氢等有害物质持续积累,原本正常的池塘养殖生态平衡被打破,严重影响养殖水产动物的正常生长发育,病害频发㊁病死率陡增.这不仅给养殖者造成了巨大经济损失,更对水环境和周边生态环境造成恶劣的影响,从而制约着池塘养殖业的发展.养殖密度大㊁投喂过量造成的养殖池塘水质恶化问题,其本质是水体中有益微生物与有害微生物间的动态平衡被打破所致.要从根本上改善这种状况,必须恢复水体中正常的微生物群落状态.因此,以微生物调控㊁原位或异位修复养殖水体的生物水处理方法便应运而生,其具有绿色㊁安全㊁环保,无毒副作用㊁无残留污染㊁不产生抗性㊁对水体不产生二次污染等优点,现已成为该领域的研究热点;且养殖水体中亚硝酸盐浓度超标是近年来鱼病频繁发生不可忽视的原因(吴桂时等,２００５).因此,近年来硝化细菌和反硝化细菌在水产养殖业上的应用越来越引起人们的注意,引发了广泛的研究.迄今为止,在大规模集约化水产养殖生产中,大都使用硝化细菌和反硝化细菌来净化水质(王玉堂,２００９).目前已从自然界中分离出许多反硝化细菌,绝大部分是异养型,包括一些兼性厌氧的芽孢杆菌属㊁假单胞菌属㊁变形杆菌属㊁葡萄球菌㊁黄杆菌属㊁微球菌属㊁产碱杆菌属种类(F r i x i o n e e t a l ,２００３).反硝化细菌因其可将亚硝酸盐转化成无毒的氮气而受到广泛的关注与研究.传统理论认为反硝化细菌是异养㊁兼性厌氧型的,在无氧条件下,该微生物利用硝酸盐或亚硝酸盐作为呼吸链的最终受体并产生A T P ,该能量可用于合成新的细胞物质和维持现有细胞的生命活动;其中,某些反硝化细菌可以将水体中的氮氧化物(N O－３和N O－２)通过气态的中间产物(N O和N２O)转化为氮气(N２),从而减轻水体中的氮污染(H a r r i se ta l,２００６;O a k l e y e ta l,２００７).因此,可利用这部分微生物的反硝化作用来控制水体富营养化以及处理污水和净化水域.微生物的反硝化作用在全球氮循环过程中起着重要作用,特别是在水质净化方面(胡朝松等,２００９).生物净化反应的根本是菌种,因此分离获得高活性的反硝化菌株,不仅有利于揭示生物脱氮机理和优化生物脱氮工艺性能,还可以为生物脱氮㊁抑制有害藻类㊁水质净化等工艺提供生产菌种,促进这些工艺的推广应用.本文从山西运城池塘养殖水体中分离出１株反硝化菌株,拟鉴定其分类地位.１㊀材料与方法１．１㊀材料１．１．１㊀菌株来源㊀从山西省运城黄河滩涂水产养殖主产区养殖中后期的池塘中取水样,用于分离筛选反硝化细菌.１．１．２㊀培养基㊀包括富集培养基和反硝化细菌筛选培养基.配方参考文献(M a r c h e s i n i e t a l,１９９２;F r i x i o n e e t a l,２００３;胡朝松等,２００９)并作改进.(A)富集培养基:蛋白胨５g㊁牛肉膏３g㊁N a N O２０．２g㊁K N O３１．０g㊁去离子水１０００m L㊁p H ７．２~７．６㊁１２１ħ高温灭菌３０m i n.固体培养基中加入２％琼脂.(B)反硝化细菌筛选培养基:N a N O２０．５g㊁N H４N O３０．５g㊁C H３C O O N a３．５g㊁酒石酸钾钠７．５g㊁M g S O４ ７H２O０．２g㊁K２H P O４０．５g㊁去离子水１０００m L㊁p H７．２㊁１２１ħ高温灭菌３０m i n.固体培养基中加入２％琼脂.１．１．３㊀试剂㊀选择奈氏试剂和格利斯试剂.１．２㊀方法１．２．１㊀菌株筛选㊀取２m L水样于１００m L A培养基中振荡培养２４h以上,得到富集菌液,将该菌悬液按照２％~３％的比例加入到B培养基中,３０ħ恒温培养３５d后梯度稀释涂板;或直接将富集菌液梯度稀释涂布于B固体培养基上,３０ħ恒温培养;然后将所长出的菌落进行划线纯化,得到初筛菌,并命名为Y JＧ１.使用奈氏试剂和格利斯试剂对其反硝化能力进行检测(M a r c h e s i n i e t a l,１９９２).１．２．２㊀菌株鉴定㊀对初筛菌落直接进行１６Sr D N A 序列扩增与测定.从平板上挑取单菌落溶于１０μL 去离子水中作为扩增模板,选择正向引物序列为５ᶄＧA G A G T T T G A T C C T G G C T C A GＧ３ᶄ,反向引物序列为５ᶄＧG G T T A C C T T G T T A C G A C T TＧ３ᶄ,引物由上海生工合成.P C R反应体系为２０μL:１０ˑP C R b u f f e r ２μL,１０mM d N T P０．４μL,１０μM的正㊁反向引物各１μL,５U/μLT a q D N A聚合酶０．１μL,D N A模板１μL,加双蒸水至总体积２０μL.P C R反应条件为:９４ħ预变性５m i n,接９４ħ变性４５s,５５ħ复性４５s,７２ħ延伸５０s,３０个循环;最后７２ħ温育１０m i n,４ħ冷却１０m i n.取６μLP C R扩增产物,采用１．２％的琼脂糖凝胶电泳检测,观察克隆片段大小,然后经中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的琼脂糖凝胶D N A回收试剂盒回收其片段,再将全部产物加入到大连宝生物工程有限公司的感受态细胞E．c o l i C o m p e t e n t C e l l s D H５α中,培养后取菌液或经T a K a R a M i n i B E S TP l a s m i dP u r i f i c a t i o n试剂盒提取大量质粒,送往大连宝生物工程有限公司测序.将测序结果在N C B I服务器(h t t p://w w w．n cＧb i．n l m．n i h．g o v)上的B l a s t软件里进行同源性比对与分析.从结果中挑选部分相似性较高的菌株和一些常见具有反硝化功能的细菌,如芽孢杆菌㊁乳酸菌和亚硝化单孢菌等作同源性比对,用M E G A５．０５软件中N e i g h b o rＧJ i o n i n g方法构建系统发育树,进行系统发育分析.２㊀结果２．１㊀反硝化细菌初筛所取水样的土著微生物经富集分离后,在反硝化细菌筛选培养基上长出一种圆形㊁乳白色㊁表面光滑㊁边缘整齐的菌落.挑取菌落在试管中液体厌氧培养２４h后,用奈氏试剂和格利斯试剂检测其反硝化效果.结果显示,奈氏试剂显示黄色,格利斯试剂显示绛红色;说明在细菌培养２４h后发酵液中产生了少部分的铵离子和较多的亚硝酸盐,具有反硝化功能.２．２㊀初筛菌１６S r D N A同源性比对与系统发育图１为初筛菌１６Sr D N A的P C R产物的琼脂糖凝胶电泳图,目的片段大小约为１５００b p.经测序得知,片段大小为１４４１b p.图２为１２种从B l a s t检索中挑选的部分相似性高的菌种和一些常见具有反硝化功能的细菌作出的无根系统发育树.图２显示,Y JＧ１与产酸克雷伯氏杆菌(K l e b s i e l l ao x y t o c a)的同源性最高.２１１第３９卷第５期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀水生态学杂志㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１８年９月图１㊀１６S r D N A 的P C R 扩增F i g ．１㊀A m p l i f i c a t i o no f １６S rD N Ab y PCR 图２㊀基于１６S r D N A 序列同源性构建的无根系统发育树F i g ．２㊀U n r o o t e d p h y l o ge n e t i c t r e e b a s e do n t h e １６S r D N A s e q u e n c e s of s t r a i nY J Ｇ１a n d r e l a t e d s pe c i e s ３㊀讨论３．１㊀土著微生物在水产养殖中的应用近年来,水产品质量安全问题越来越受到重视.在生产分散㊁规范化㊁标准化执行不力的背景下,养殖者盲目使用抗生素㊁促生长激素等药物治疗鱼病㊁争取提早上市或杀灭有害藻类的做法,严重影响着水产品质量安全(张清,２００９).目前,国家规定的违禁渔药种类越来越多,逐步被商品化的微生态制剂所取代.通过施用微生态制剂虽然可以简单㊁方便的改善养殖水质.然而,也存在一定的局限性,如同一种微生态制剂,在某地区某种水质中使用效果很好,但在同一地区不同水质或不同地区不同水质中,即使加大使用量都几乎没有明显效果.能找到一种行之有效㊁投入少㊁见效快㊁效力持续时间长的微生态制剂势在必行.土著微生物因长期生活于其原有生境,比外来菌更能适应当地环境,在繁殖存活率㊁生物活性等方面均有着得天独厚的优势;此外,利用土著菌调控水质,还能最大限度地避免外来物种入侵等生态问题.肖国华等(２０１１)为了修复因网箱养殖而遭到污染的白洋淀水环境,采集试验区泥样,经富集培养,并通过其对鱼饵料C O D 去除率的测定,筛选出１０株有机污染降解土著菌,选择其中４种制备微生态制剂,实际应用表明,能有效降解水中有机物,改善养殖环境;邵朝臣等(２０１２)通过投加土著微生物菌剂降解黑臭河水中的污染物质,同时采用其他措施,使温州屿田㊁上庄河全河段主要水质指标维持在地表水近Ⅴ类水平,黑臭现象完全消除,且使水体具有一定的自净能力.土著微生物以其针对性强㊁效果佳㊁安全性高㊁成本低以及作用持续时间长而成为目前水产养殖水质净化方法研究的重点.３．２㊀反硝化细菌K l e b s i e l l ao x yt o c a 的功能与G e n B a n k 数据库比对和基于１６Sr D N A 序列同源性构建的无根系统发育树分析结果显示,初步分离筛选得到的菌株Y J Ｇ１与反硝化细菌产酸克雷伯氏菌(K l e b s i e l l ao x y t o c a )的同源性最高.克雷伯氏菌属(K l e b s i e l l a )细菌是无动力㊁有荚膜的革兰氏阴性杆菌,可迅速发酵葡萄糖产酸或产酸产气,具有不产生硫化氢的特性(刘红英等,２００６).２０世纪９０年代,李树品等(１９９１)分离筛选到高固氮酶活性菌株产酸克雷伯氏菌,可用于提高小麦单位面积产量;F r a n c oB a l d i 等(２００１)分离到的克雷伯氏菌B A S Ｇ１０具有较强的耐受重金属的能力;R yo s u k e S u g i h a r a 等(２０００)将克雷伯氏菌T MN ３菌发酵后获得胞外多糖A Z Ｇ９,并研究了该糖对胶原质诱发的小鼠关节炎的抑制作用,实验表明抑制效果良好.该反硝化细菌功能较多,应用领域广泛.３．３㊀反硝化细菌在水产养殖业的应用前景在水产养殖中,最初所使用的微生态制剂成分大多数仅为光合细菌㊁乳酸菌和芽孢杆菌中的一种或几种,品种较为单一.随着池塘集约化养殖程度的加大,水体富营养化程度的加剧,微生态制剂的研发热潮也随之兴起.目前,微生态制剂中菌类的品种逐渐增多,尤其是硝化细菌和反硝化细菌成为了不可或缺的种类.针对在水产养殖周期内的中后期,池塘水体实际鱼载力往往达到甚至超过理论值,残饵㊁粪便㊁养殖生物残骸等有机物质不断积累,氨氮㊁亚硝酸盐含量持续升高,水体溶解氧含量下降,鱼体发病率上升等问题.众多学者研究发现,将具有反硝化功能的不同菌种按照合理的比例配比复合后使用,可大大减轻氨氮㊁亚硝酸盐含量持高不下的问题.张峰峰等(２０１２)将反硝化细菌㊁芽孢杆菌和乳酸菌三者降解N O －２的能力作了比较,结果显示降解速度不同,反硝化细菌＞乳酸菌＞芽孢杆菌,将３１１２０１８第５期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀张㊀元,池塘养殖水体中土著反硝化细菌的分离与初步鉴定这３种菌以１ʒ２ʒ１混合,效果最佳,降解率大于９９ ９９％.反硝化细菌除了有此特效外,还可大量消耗藻类过度繁殖水体中的氮元素,切断藻类氮营养素,维护良好水色.菌株在溶氧充足及厌氧条件下均可生存并进行反硝化反应,优化底质的理化环境.作为土著反硝化细菌被分离出来的克雷伯氏菌,其同样具有降低养殖水体中亚硝酸盐含量㊁减小鱼体发病率的功能,但对该土著菌降解亚硝酸盐的速率㊁与其他具有反硝化功能的细菌降解速率比较以及与光合细菌㊁芽孢杆菌㊁乳酸菌等不同种类细菌按照什么比例配比的工艺等等问题有待进一步探究.此项工艺的确定,可作为制备土著微生态制剂的模型来借鉴.目前多数研究仅停留在微生物的分离筛选和功能鉴定上,很少将特定区域内分离筛选得到的菌种进行配伍,再返投回污染区进行生物治理.本文旨在将养殖池塘水体中的土著微生物分离筛选后进行科学配伍生产土著微生态制剂,从而对养殖废水进行生物修复,提高水产养殖的经济效益㊁生态效益和社会效益.这样的生物治理针对性强㊁成本低㊁效果显著,主要应用于污水处理,如景观水处理㊁城市内河治理㊁水产养殖水处理等,尤其在水产养殖废水处理中的应用前景最大.参考文献邓来福,江兴龙,２０１３．池塘养殖生物修复技术研究进展[J]．海洋与湖沼,４４(５):１２７０１２７５．胡朝松,李春强,刘志昕,等,２００９．海洋沉积物中反硝化细菌的分离鉴定及消化性能研究[J]．环境科学研究,２２(１):１１４１１８．李树品,蒋千里,楚杰,等,１９９１．产酸克雷伯氏杆菌(K l e bＧs i e l l ao x y t o c a)的分离及其特性研究[J]．山东科学,４(３):１９２５．刘红英,薛长湖,张辉,等,２００６．产酸克雷伯式菌(K l e b s i e l l a O x y t o c a X C 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AＧ１m i c eb y o r a l a d m i n i s t r a t i o no fA ZＧ９,ab a c t e r i a l p o l y s a c c h a r i d e f r o m K l e b s i e l l ao x y t o c a[J]．I mm u n o pＧh a r m a c o l o g y,４９:３２５３３３．S t e v e n s o nRJ,B e n n e t t B J,D o n i e l l eNJ,e t a l,２０１２．P h o sＧp h o r u s r e g u l a t e s s t r e a mi n j u r y b y f i l a m e n t o u s g r e e na lＧg a e,D O,a n d p H w i t ht h r e s h o l d si nr e s p o n s e s[J]．H y d r o b i o l o g i a,６９５(１):２５４２．(责任编辑㊀万月华)４１１第３９卷第５期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀水生态学杂志㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１８年９月I s o l a t i o na n dP r e l i m i n a r y Id e n t i f i c a t i o no fN a t i v eD e n i t r i f i c a t i o n B a c t e r i a f r o ma nA qu a c u l t u r eP o n d Z H A N G Y u a n(S h a n x i P r o v i n c eS c i e n c e a n dE x p e r i m e n tC e n t e r o fA q u a t i cB r e e d i n g ,T a i y u a n ㊀０３０００２,P ．R．C h i n a )A b s t r a c t :W a t e r q u a l i t y d e t e r i o r a t i o n i na q u a c u l t u r e p o n d s i sas e r i o u s p r o b l e m ,a n dv a r i o u sc o mm e r c i a l m i c r o b e p r e p a r a t i o n s h a v e e m e r g e d ,b u t t h e y h a v en o t e f f e c t i v e l y i m p r o v e dw a t e r q u a l i t y ．T h i s s t u d y ad Ｇd re s s e s t h e p r o b l e m ,u s i n g d i r e c t i o n a l s e p a r a t i o n ,s c r e e n i n g ,a n d p r o p a g a t i o nof b e n e f i c i a l i n d i ge n o u s b a c Ｇt e r i a w i t h t h e o b j e c t i v e o fi m p r o v i n g b i o Ｇr e s t o r a t i o n ,p u r if i c a t i o n a n d r e m e d i a t i o n o f a q u a c u l t u r e w a s t e w a t e r ．T h i s a p p r o a c hh a s t h e a d v a n t ag e s o f b e n e f i c i a l e f f e c t ,hi g h s a f e t y ,l o wc o s t ,e x t e n d e d a c t i v i t ya n dn o s e c o n d a r yp o l l u t i o n ．I n t h i s s t u d y ,o n en a t i v ed e n i t r i f y i n g ba c t e r i a ,n a m e dY J Ｇ１,w a s i s o l a t e da n d s c r e e n e d f r o m p o n dw a t e r d u r i n g t h em i d Ｇl a t e s t a g e (S e p t e mb e r )o f t h e ２０１６a q u ac u l t u r e s e a s o n ．T h e p o nd w a s l o c a te d i n t h eY e l l o wR i v e r t i d a lf l a t o fY u n c h e ng C i t y ,th em ai n f i s h p r o d u c t i o n a r e a o f S h a n x i P r o v Ｇi n c e ．D u r i n g d e n i t r i f i c a t i o n c a p a c i t y t e s t i n g ,a mm o n i aw a sd e t e r m i n e dw i t hN e s s l e r r e a g e n t (ye l l o w )a n d n i t r i t ew a s d e t e r m i n e dw i t hG r i e s r e a g e n t (r e d )．Af t e r ２４ho f f e r m e n t a t i o n ,a mm o n i aw a s a t a l o wc o n Ｇc e n t r a t i o na n dn i t r i t ew a s p r o d u c e d ,i n d i c a t i ng d e n i t r i f i c a t i o n ．Th e r e s u l t s o f １６Sr D N Aa m p li f i c a t i o na n d s e q u e n c i n g i n d i c a t e d a f r a g m e n t l e n g t ho f １４４１b p ．U n r o o t e d p h y l o g e n e t i c t r e e a n a l y s i s s h o w e d t h a tY J Ｇ１a n d K l e b s i e l l ao x yt o c a h a d t h eh i g h e s t h o m o l o g y ．S u c c e s s f u l i s o l a t i o no fY J Ｇ１i n t e r r u p t s t h e t r e n do fm i Ｇc r o b e p r e p a r a t i o n s c o m i n g f r o mc o mm e r c i a l s o u r c e s ．I f n a t i v e d e n i t r i f y i n g b a c t e r i aw e r e a d d e d t o p r e pa r a Ｇt i o n s ,a mm o n i a a n dn i t r i t e n i t r o g e n i n a q u a c u l t u r ew a t e r c o u l db e e f f ec t i v e l y r ed u ce d ．D e n i t r if y i ng b a c t e r i a sh o w g o o d p o t e n ti a l f o ra p p l i c a t i o ni na q u a c u l t u r ew a s t e w a t e r p u r i f i c a t i o na n du r b a ns e w a get r e a t m e n t ．T h i s s t u d y a l s o p r o v i d e s a p r o m i s i n g m e t h o d f o r i s o l a t i o n ,s c r e e n i n g ,i d e n t i f i c a t i o n a n d a p pl i c a t i o no f o t h Ｇe r b e n e f i c i a l n a t i v eb a c t e r i a ．K e y wo r d s :a q u a c u l t u r e p o n d ;a q u a c u l t u r ew a s t e w a t e r ;n a t i v ed e n i t r i f y i n g b a c t e r i a ;i s o l a t i o n ;i d e n t i f i c a Ｇt i o n５１１２０１８第５期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀张㊀元,池塘养殖水体中土著反硝化细菌的分离与初步鉴定。
