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16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个局部：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进展PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
试剂：培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基〔培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进展洗涤。
〕。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)〔1L〕：121.1g Tris，加浓盐酸约〔70ml, 60ml, 42ml〕pH大约下降0.03个单位。
(Tris-HCl缓冲液〔0.05mol/L，25Tris〕溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一) 0.5M EDTA〔pH8.0〕〔1L〕：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0〔约20g〕,高温高压灭菌，室温保存。
(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。
2. 参加约800mL的去离子水，充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0〔约20g NaOH〕。
注意：pH值至8.0时，EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。
6. 室温保存。
〕1.4 10×TE Buffer(缓冲液〕(pH7.4，7.6，8.0)〔1L〕：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl〔pH7.4，7.6，8.0〕取100ml，0.5M EDTA〔pH8.0〕取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS〔W/V〕：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
一、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：PCR实验原理即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker，溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0）三、操作方法1. 细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
16s rdna测序原理16s rDNA测序是一种用于研究微生物群落结构和功能的重要技术，它可以帮助科研人员了解微生物的多样性和相互关系，对环境微生物的研究具有重要意义。
本文将介绍16s rDNA测序的原理及其在微生物学研究中的应用。
16s rDNA是细菌和古细菌的小亚基RNA基因的一部分，它在所有细菌和古细菌中都存在，并且在细菌的进化过程中具有高度的保守性。
因此，通过对16s rDNA序列进行测序和比对，可以帮助科研人员了解不同微生物的分类和演化关系。
在进行16s rDNA测序时，首先需要从样品中提取微生物的DNA，然后通过PCR扩增得到16s rDNA的片段。
接下来，对PCR产物进行纯化和测序准备，最常用的方法是通过测序仪进行Sanger测序。
随着高通量测序技术的发展，现在也可以使用Illumina、454或Ion Torrent等平台进行高通量测序，大大提高了测序的效率和速度。
得到16s rDNA序列后，接下来的工作就是对序列进行比对和分析。
科研人员可以利用公开数据库中的16s rDNA序列作为参考，通过比对来确定待测序列的分类地位和系统发育关系。
此外，还可以利用一些生物信息学工具对序列进行多样性分析、物种丰度分析等，从而了解微生物群落的结构和功能。
在微生物学研究中，16s rDNA测序被广泛应用于环境微生物群落的研究。
通过对土壤、水体、空气等不同环境中微生物的16s rDNA进行测序和分析，可以揭示微生物的多样性、分布规律以及其对环境的影响。
此外，16s rDNA测序还可以用于研究人体内的微生物群落，例如肠道菌群的研究，有助于了解微生物与宿主健康的关系。
总之，16s rDNA测序是一种重要的技术手段，它为科研人员提供了解微生物多样性、分类和系统发育关系的重要途径，对微生物学、生态学和生物医学研究具有重要意义。
随着测序技术的不断发展和完善，相信16s rDNA测序在微生物学研究中的应用将会更加广泛和深入。
一、 实验原理 随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA 杂交、rDNA 指纹图、质粒图谱和16SrDNA 序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5SrRNA 、16SrRNA 、23SrRNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
16SrRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16SrDNA 。
5SrRNA 虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp ，没有足够的遗传信息用于分类研究；23SrRNA 含有的核苷酸数几乎是16SrRNA 的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16SrRNA 相对分子量在2kb 左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16SrRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16SrDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA 的过程。
是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA 。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、TaqPolymerase、DNAMarker，溶菌酶、dNTP和感受态细胞、pMD18-TVector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（）三、操作方法1.细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
(1)菌体收集：取新鲜的菌液于EP管中，12000r/min离心30s，弃净上清，收集菌体。
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个局部：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进展PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
试剂：培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基〔培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进展洗涤。
〕。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)〔1L〕：121.1g Tris，加浓盐酸约〔70ml, 60ml, 42ml〕pH大约下降0.03个单位。
(Tris-HCl缓冲液〔0.05mol/L，25Tris〕溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一) 0.5M EDTA〔pH8.0〕〔1L〕：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0〔约20g〕,高温高压灭菌，室温保存。
(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。
2. 参加约800mL的去离子水，充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0〔约20g NaOH〕。
注意：pH值至8.0时，EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。
6. 室温保存。
〕1.4 10×TE Buffer(缓冲液〕(pH7.4，7.6，8.0)〔1L〕：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl〔pH7.4，7.6，8.0〕取100ml，0.5M EDTA〔pH8.0〕取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS〔W/V〕：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
用16S rDNA 方法鉴定细菌种属一、实验目的1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。
二、实验原理细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。
16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。
16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。
在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。
16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：细菌基因组的提取：PCR 的基本原理 ：PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
一、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：PCR实验原理即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker，溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0）三、操作方法1. 细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
细菌16S rDNA序列比对进化树构建生物科学131班 13213103王馨悦一、实验目的学习并掌握使用MEGA软件构建细菌16S rDNA的进化树二、实验原理1、细菌识别与鉴定手段的发展1）传统的表型观察：群体（菌落）、个体2）生理生化分类：如格兰仕阳性或阴性细菌的鉴定3）分子水平鉴定：如（G+C）mol%、16SrDNA等，具有耗时短，成本低，准确性高的优点2、rRNA的特性1）具有重要且恒定的生理功能；2）约占细胞中RNA含量的90%，易于提取3、细菌中包括三种rRNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA1）5S rRNA核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究2）23S rRNA核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难3）16S rRNA适于作为序列分析对象的依据a.在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；b.16S rRNA分子分子量大小适中，约1540bp，便于序列分析；c. 16S rRNA普遍存在于真核生物和原核生物中（真核生物中其同源分子是18S rRNA）。
因此它可以作为测量各类生物进化的工具。
三、实验步骤1、NCBI序列下载根据实验中老师提供的Genbank登录号（EF012357，AF506513，AB017203）在NCBI上 (/blast/Blast.cgi)下载菌株的序列2、Eztaxon序列比对将前一步所得的菌株序列在Eztaxon网站进行序列比对，并下载亲缘关系较近的模式菌株序列如图（/eztaxon）a.选择同属亲缘关系较近的模式菌株选择的原则：依据同源关系由近而远，代表每个种的菌株一到三个左右，尽可能选择同属的菌株，同属菌株很少的，可以选择近缘属的模式菌株或其他代表菌株b.将所选序列（Fasta格式文件）下载保存3、MEGA构建进化树四、实验结果1、EF012357五、总结与收获通过本次实验我对16S rRNA用于进化分析的原理及意义有了全面深刻的了解和体会；并且在多次练习中初步掌握了MEGA软件结合NCBI数据库和Eztaxon模式菌株网站进行的序列查找、选择、比对、构树及修饰等操作；学会了构建进化树反映生物间的亲缘关系。
16s rdna测序原理16S rDNA测序是一种常用的微生物多样性分析方法，通过对16S rDNA基因的测序和分析，可以揭示微生物群落的组成和结构，对环境微生物的研究具有重要意义。
本文将介绍16S rDNA测序的原理及相关内容。
1. 16S rDNA基因简介。
16S rDNA是细菌和古细菌的小亚基核糖体RNA基因，其序列在细菌中高度保守，但又存在一定的变异性，这使得16S rDNA成为研究微生物系统发育和分类的理想分子标记。
在细菌和古细菌中，16S rDNA一般由9个高度保守的区域（称为conserved region）和10个变异区域（称为variable region）组成，其中变异区域的序列差异较大，可用于微生物的分类和鉴定。
2. 16S rDNA测序原理。
16S rDNA测序的原理是通过PCR扩增获得16S rDNA基因片段，然后对扩增产物进行测序，最后对测序结果进行分析和解读。
首先，从样品中提取微生物DNA，然后利用通用或特异引物对16S rDNA基因进行PCR扩增，得到所需的16S rDNA片段。
接下来，对PCR产物进行纯化和测序，通常采用Sanger测序法或高通量测序技术（如Illumina、454、Ion Torrent等）。
最后，利用生物信息学方法对测序结果进行分析，包括序列比对、物种注释、多样性分析等。
3. 16S rDNA测序分析。
在16S rDNA测序分析中，首先需要对测序结果进行质控和过滤，去除低质量序列和引物污染，然后进行序列比对和物种注释。
序列比对是将测序结果与16S rDNA数据库进行比对，找到最佳匹配的参考序列，从而确定微生物的分类和系统发育关系。
物种注释是根据比对结果，将未知序列注释为已知的微生物分类单元，如属、种等。
此外，还可以进行多样性分析，如Alpha多样性指数（反映微生物群落的丰富度和多样性）、Beta多样性分析（比较不同样品间的微生物群落差异）等。
实验三环境16srdna文库的构建实验三环境16S rDNA文库的构建与组成分析技术上海交通大学微生物分子生态学和环境基因组学实验室一、概述生态学是研究生物体之间以及生物体与环境之间相互作用的科学进行生态系统中物种种类、丰度以及分布的调查是进行生态学研究的重要前提条件?研究环境中微生物种类和丰度的方法–传统的微生物分离纯化的方法：环境中大多数微生物目前无法得到纯培养，很不全面，有很大的偏好性–基于基因组中“biomarker”的方法：如构建环境16SrDNA文库的方法，不需要获得纯培养，更好地反映环境中微生物的组成1990年，Giovannoni等首先用这一方法分析马尾藻海海面上浮游微生物的多样性–16S rDNA文库中的蓝藻种类与培养出来的蓝藻很不一致–发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群SAR11–与传统的分离培养的方法相比，更全面得揭示了微生物多样性这一方法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查，揭示了环境当中前所未知的微生物的多样性。
二、实验原理16S rDNA是基因组的“biomarker”–核糖体RNA是蛋白质合成必需的，16S rDNA广泛存在于所有原核生物的基因组中。
–16S rDNA的序列中包括保守区和可变区。
–序列变化比较缓慢，与物种的形成速度相适应，而且一般不发生水平转移。
–GeneBank和RDPⅡ（Ribosomal DatabaseProject ）数据库中已经登录了超过97,128个经过比对和注释的16S rDNA序列，可供进行比对。
构建环境16S rDNA文库的方法–用环境基因组总DNA进行16S rDNA PCR扩增：把环境中几乎所有微生物基因组上的16S rDNA 扩增并收集到一起–“TA克隆”：把每一个16S rDNA分子放到文库中的每一个克隆里。
克隆文库的筛选原理pGEM-T Easy Vector 的图谱宿主菌：DH5α阳性克隆筛选的过程：1.Amp抗性，挑选出含有质粒的克隆2.蓝白斑筛选，挑出带有插入片段的克隆3.PCR筛选，挑出带有正确长度插入片段的克隆16S rDNA 扩增及胶纯化16S rDNA 扩增产物与T 载体连接连接产物转化大肠杆菌克隆文库的筛选克隆文库的统计分析三、实验步骤制备大肠杆菌感受态细胞ARDAR 分型与测序（一）16S rDNA 的PCR 扩增及纯化（不做）Mr Nc SMr S16S rDNA 扩增割胶纯化后Mr:分子量标准Nc:阴性对照S: 样品，焦化废水处理装置缺氧池1500bp1500bp（二）PCR 产物的连接（不做）连接产物的琼脂糖凝胶电泳1 Mr4268bp1584bp1μlT4 DNA ligase (2Weiss units/μl)75ng PCR product1μl pGEM -T Easy Vector(50ng/μl)5μl 2 X Rapid Ligation Buffer 加入ddH 2O 使连接体系的总体积为10uL ，混匀，4℃水浴连接16h 。
一、实验原理
随着分子生物学的迅速发展,细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平,如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱与16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA,分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA,rRNA 基因由保守区与可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析,但核苷酸太少,仅几十bp,没有足够的遗传信息用于分类研究;23S rRNA含有的核苷酸数几乎就是16S rRNA的两倍,分子量太大,分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右,较为适合PCR扩增,又具有保守性与存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因就是16SrDNA,但就是要直接将16SrRNA提取出来很困难,因为易被广泛存在的RNase降解,因而利用16S rDNA鉴定细菌,其技术路线如下:
PCR实验原理
即聚合酶链式反应,就是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定
引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
就是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂
PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker,溶菌酶、dNTP与E、coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE(pH 8、0)
三、操作方法
1、细菌基因组总DNA的提取
接种纯化的菌株于LB液体培养基中,180 r/min,37 ℃培养过夜,按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
(1)菌体收集:取1、5 mL新鲜的菌液于EP管中,12000 r/min离心30 s,弃净上清,收集菌体。
(2)辅助裂解:加100 μg/mL溶菌酶50 μL,37 ℃处理30min。
(3)裂解:向每管加入200 mL预冷的SDS裂解缓冲液,用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮与裂解细菌细胞。
(4)向每管加入66 μL 5 mol/L NaCl,充分混匀后,12000 r/min离心10 min,除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。
(5)将上清转移到新EP管中,加入等体积的Tris-饱与酚,充分混匀,12000 r/min 离心3 min,进一步沉淀蛋白质。
(6)取离心后的水层,加等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1),充分混匀后,12000 r/min离心3 min,去除苯酚。
(7)小心取上清,用预冷2倍体积的无水乙醇沉淀DNA,13000 r/min离心15 min,弃上清。
(8)用400 μL75%的乙醇洗涤沉淀2次。
(9)室温干燥后,用40 μL 1×TE溶解DNA。
(10)1、0%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。
(11)提取的基因组总DNA-40 ℃冰箱保存备用。
2、PCR扩增细菌的16S rDNA
(1)16S rDNA的PCR引物:采用细菌的通用引物27F与1492R
(2)PCR反应体系为(20μL): 灭菌蒸馏水8、9 μL,
10×buffer 2 μL,
10 mmol/L dNTP 0、4 μL,
27F与1492R引物各 4 μL,
DNA模板0、5 μL,
Taq polymerase 0、2 μL。
(3)PCR反应条件:
93 ℃预变性5 min、94 ℃变性18 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸78 s,循环30次,72 ℃延伸7 min。
(4)1、0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
3、PCR扩增目的片断的纯化
通过PCR扩增出大量的目的片段,经1、0%琼脂糖凝胶电泳分离后,在紫外灯下切下含有目的条带的胶块装入1、5 mL的EP管中,用B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收DNA,操作按说明书进行,方法如下:
(1)加入700 μL溶胶液,55 ℃水浴溶胶,其间偶尔摇动,直至胶块全部溶解。
(2)将溶胶液转移至吸附柱中,12000 r/min离心30 s,重复一次,提高回收率。
(3)向吸附柱中加入500 μL漂洗液,12000 r/min离心30 s,倒掉废液,重复漂洗一次。
12000 r/min离心2 min以完全去除漂洗液。
(4)将吸附柱移至一个干净的1、5 mLEP管中,向吸附柱膜中央加入40 μL的洗脱缓冲液,12000 r/min离心2 min收集DNA。
(5)回收DNA用1、0%琼脂糖凝胶电泳检测。
4、16S rDNA目的片断的克隆
PCR纯化产物与pMD18-T载体连接体系(10 μL):胶回收产物2 μL,pMD18-T 载体1 μL,SoulutionⅠ5 μL,无菌去离子水2 μL,16 ℃连接4 h。
转化E、coli JM109
(1)取50 μL E、coli JM109感受态细胞于冰中融化。
(2)将5 μL连接产物加入到已融化的感受态细胞中,轻轻吸打混匀,冰浴30 min。
(3)42 ℃保温90 s。
(4)冰浴2~3 min。
(5)加入450 μL LB液体培养基,轻轻混匀,200 r/min,37 ℃培养40 min。
(6)取适量上述培养液均匀涂布在Amp/X-Gal/IPTG的LB平板上,37 ℃培养过夜。
5、转化子的筛选与鉴定
(1)重组菌株的菌落PCR
通过蓝白斑筛选阳性转化子,用灭菌的枪头将白色菌落接种至4 mL LB液体培养基中,200 r/min,37 ℃培养4 h。
取菌液作为PCR模板。
PCR反应体系(20 μL):灭菌蒸馏水7、4 μL,10×PCR buffer(含15 mmol/L MgCl2)2 μL,10 mmol/L dNTP 0、4 μL,2、5 μmol/L的上游与下游引物各4 μL,菌液2 μL,5U/μL Taq polymer ase0、2 μL。
PCR反应条件:93 ℃预变性5 min、94 ℃变性18 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸78 s,循环30次,72 ℃延伸7 min。
1、0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
(2)重组质粒的核苷酸序列的测定
对经过鉴定含有目的片断的单克隆菌液加入甘油-40 ℃保存,同时将同一单克隆菌液送上海生工生物工程有限公司进行序列测定,将测得的序列提交GenBank数据库,根据测序结果,用BLAST搜索软件在NCBI()的GenBank数据库中调出相似性较高的16S rDNA基因序列,用ClustalX 1、81软件进行多序列比对,用Phylipwx软件包中的Seqboot,Dnapars与Consense进行同源性分析并构建系统发育树。
四、实验结果提交
鉴定菌株的序列与哪个种最匹配,并构建该菌株的系统进化树。
