_甘露聚糖酶的研究进展

󰀁临床药学󰀁󰀁-甘露聚糖酶的研究进展张󰀁婕,赵󰀁敏*东北林业大学生命科学学院(150040)摘󰀁要󰀁󰀁-甘露聚糖酶是水解甘露聚糖和异甘露聚糖中󰀁-1,4-D-甘露糖苷键的水解酶,水解后的功能性低聚糖具有调节机体免疫系统、低人体胆固醇和血糖水平等功效。本文对󰀁-甘露聚糖酶的来源、作用方式、遗传基础、纯化方法及其应用领域等方面进行简要综述。关键词:󰀁-甘露聚糖酶;来源;作用方式;遗传基础中图分类号:Q814󰀁9󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码:A文章编号:1006-2882(2011)02-248-03甘露聚糖类物质是自然界中半纤维素的第二大组分,甘露聚糖类物质的降解主要依靠的酶类是󰀁-甘露聚糖酶[󰀁-1,4-D-mannanmannohydrolase,EC3󰀁2󰀁1󰀁78][1],它广泛存在于动物、植物和微生物中。󰀁-甘露聚糖酶早期的研究工作主要是产酶菌株的选育,发酵条件优化、酶的纯化和理化性质,酶水解作用机理等方面,随着基因和蛋白质工程技术的广泛运用,󰀁-甘露聚糖酶的研究开始转向酶基因的克隆表达和活性位点等方面的研究。本文在目前已有的研究基础上,就󰀁-甘露聚糖酶的微生物来源、作用方式、纯化方法、遗传基础以及应用领域等方面简单介绍,提供进一步研究的参考。1󰀁󰀁-甘露聚糖酶的来源和性质1󰀁1󰀁󰀁-甘露聚糖酶的来源󰀁-甘露聚糖酶广泛存在于自然界中,在一些低等动物(如海洋软体动物、淡菜以及蜗牛等)的肠道分泌液,植物(四棱豆、长角豆、咖啡豆、瓜儿豆等萌发的种子以及天南星科植物魔芋萌发的球茎)和微生物(包括细菌、真菌和放线菌)中都有甘露聚糖酶活力[2]。微生物来源的󰀁-甘露聚糖酶具备活性高、成本低、提取方便以及比动植物更广的作用pH、温度范围和底物专一性等显著特点,成为近年来的研究热点和工业用酶的主要来源,尤其是极端微生物生长的特殊条件很大程度与工业环境相近,随着对极端酶反应机理和分子生物学研究的逐步深入,开发极端酶产品具有广阔的前景[3]。细菌中的芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌,真菌中的曲霉、木霉、酵母、青霉、多孔菌、核盘菌,放线菌中的链霉菌等是产󰀁-甘露聚糖酶的常见类群[4]。目前,应用于工业生产的󰀁-甘露聚糖酶多为芽孢杆菌、曲霉、里氏木霉、酵母以及工程菌,此外,国内已有从欧文氏杆菌[5]、短小芽孢杆菌[6]、海栖热孢菌[7]和棘孢曲霉[8]等微生物中得到󰀁-*赵敏为本文通讯作者。甘露聚糖酶的报道,并对产酶基因和酶学性质进行了研究。1󰀁2󰀁󰀁-甘露聚糖酶的性质不同微生物产生的󰀁-甘露聚糖酶的相对分子质量、最适反应条件和等电点等性质都有一定差异[4]。不同来源󰀁-甘露聚糖酶的相对分子质量间相差较大。细菌中,研究最详细的是芽孢杆菌,其产生的󰀁-甘露聚糖酶等电点为4󰀁0~5󰀁5,最适反应温度为50~70󰀁,最适pH值除嗜碱芽孢杆菌高至9󰀁0~10󰀁0外,多为5󰀁5~7󰀁0,一般都有耐热性较强。真菌来源的󰀁-甘露聚糖酶pH为4󰀁0~5󰀁0,最适pH值为4󰀁5~5󰀁5,最适反应温度为55~75󰀁。相对细菌而言,真菌来源的󰀁-甘露聚糖酶pH值稳定性、最适反应pH值都偏低,耐热性也比芽孢杆菌弱。植物细胞产生的󰀁-甘露聚糖酶最适反应温度和耐热性比细菌和真菌低,最适反应pH值为4󰀁5~5󰀁5,略显酸性。2󰀁-甘露聚糖酶的作用方式和水解产物󰀁-甘露聚糖酶是一类能水解含甘露糖的多糖水解酶的总称,根据酶作用底物特异性和作用特点可以分为外切󰀁-甘露聚糖酶和内切󰀁-甘露聚糖酶两种类型。甘露聚糖类物质的降解主要依靠的是内切󰀁-甘露聚糖酶,它能够水解甘露聚糖和异甘露聚糖(半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖)中的󰀁-1,4-D-甘露糖苷键,即󰀁-甘露聚糖酶对底物有严格的键专一性。吴襟[9]认为甘露聚糖主链的甘露糖基上第6位自由羟基可能是酶结合底物的重要位点,其被修饰或取代,能不同程度地影响酶的水解速度同时由于构成这些甘露多聚糖的单糖类型、聚合度、糖键连接及排列方式等情况各异,导致不同的多糖在溶解度、粘度、稳定能力等性质上存在着明显的差别。这些因素也都极大影响了󰀁-甘露聚糖酶的水解,难溶性的甘露多聚糖一般较可溶性的难水解,糖组份复杂的一般较组份简单的难水解,主链糖基上6位自由羟基数量少的一般较多的难水解,多分支侧链的甘露聚糖一般较少分支线状的难水解。甘露聚糖经󰀁-甘露聚糖酶作用后,通过HPLC或纸层析方法分析,主要产物是寡聚糖(一般2~10个残基),产物聚合度的大小与酶和底物的来源有关,但相对而言,产生单糖(甘露糖)很少或几乎不产生单糖[10-11]。其它一些糖苷水解酶类与󰀁-甘露聚糖酶一起作用时,能提高多糖的水解效率、产生不同降解程度的水解产物。3󰀁󰀁-甘露聚糖酶酶活力的测定酶活性的测定对确定󰀁-甘露聚糖酶的活性水平,特异性及分类有重要影响。目前测定󰀁-甘露聚糖酶活的方法有:还原糖法(包括蒽酮法、地衣酚-硫酸法、DNS法、斐林法等)、测粘法、刚果红染色法、考马斯亮蓝染色法等[12],最普遍的方法是通过DNS法测定还原糖含量,间接测定󰀁-甘露聚糖酶活性水平。还原糖测定法操作简单、重复性好、反应时间短,但是相比其它的方法,这种方法的专一性比较差,因此在确定󰀁-甘露聚糖酶酶活时一般还需结合其它方法,如薄层层析法、纸层析法进行水解产物的鉴定。初步筛选产甘露聚糖酶菌株一般采用刚果红染色法,可以通过多聚󰀁248󰀁黑龙江医药HeilongjiangMedicineJournalVol󰀁24No󰀁22011糖结合的染料一刚果红染色后,在菌落周围产生透明环的方法直接地看见微生物产酶的情况。4󰀁󰀁-甘露聚糖酶的分离纯化󰀁-甘露聚糖酶常含有多种分子型且与其它糖苷酶共存,因此酶的纯化有一定的难度。大量研究表明󰀁-甘露聚糖酶一般以胞外诱导酶形式存在于生物体中只有很少的以结构酶形式存在,因此对于胞外酶目前一般采用将发酵后去除菌体的酶液先用硫酸铵盐析或有机溶剂沉淀,再用离子交换柱层析、分配柱层析和亲和层析等方式分级处理。到目前为止,枯草芽孢杆菌、黑曲霉和里氏木霉的󰀁-甘露聚糖酶获得了蛋白结晶,许多来源的󰀁-甘露聚糖酶都获得了较纯的酶。国内田新玉[13]首先报道了经过硫酸铵沉淀、两次离子交换柱层析及制备PAGE等步骤,得到了嗜碱芽孢杆菌N16-5产生的三种胞外碱性󰀁-甘露聚糖酶的凝胶电泳纯样品。吴襟获得了诺卡氏菌形放线菌菌株NA3-540的凝胶电泳均一的蛋白样品,并对得到的电泳纯󰀁-甘露聚糖酶的活性必需基团和二级结构进行分析。杨文博、余红英、田亚平、王和平分别报道了地衣芽胞杆菌NK-27、枯草芽孢杆菌SA-22、黑曲霉WX-96和里氏木霉RutC-30产生的󰀁-甘露聚糖的纯化方法和性质。也有报道从动植物中分离得到󰀁-甘露聚糖,如Yamaura先后从海螺Pomaceainsula󰀁rus的内脏和海洋软体动物Littorinabrebicula中纯化到相对分子质量44KDa和42KDa的󰀁-甘露聚糖酶。赵娜从蜗牛肝脏分离到󰀁-甘露聚糖酶,相对分子质量37KDa[14]。陶乐平从南欧紫荆萌发种子中纯化到由两个分子量为20KDa的亚基组成的󰀁-甘露聚糖酶[14]。5󰀁󰀁-甘露聚糖酶的遗传基础McClearyB󰀁V󰀁提出了󰀁-甘露聚糖酶存在两种分子作用模型[15],模型󰀁:存在5个基团结合位点(󰀁-甘露聚糖酶来自瓜胶),模型󰀁:存在4个基团结合位点(󰀁-甘露聚糖酶来自黑曲霉),近来有一些研究对该模型进行了完善和补充。目前已发现的󰀁-甘露聚糖酶分属于5,26和113三个糖苷水解酶家族,虽然在一级序列上不同的󰀁-甘露聚糖酶表现出了一定的差异,但是它们的空间位置和功能相同[16]。家族5的成员的氮基酸序列区别较大,因而又分成8个亚家族,从亚家族Al到AS[17],它们具有8个保守的氨基酸残基构成的催化活性口袋,催化域都是采用TIM桶状结构[18]。大多数󰀁-甘露聚糖酶分子的催化区域两侧或一侧还含有纤维素结合区域(CBD)或甘露聚糖结合区域(MBO),这一特性可能是植物纤维素和半纤维素总是伴随存在于植物的组织结构中的一种反应,有利于酶更好的结合靶物质,也有利于破坏植物聚糖的晶体结构,促进水解[19]。目前,一些微生物来源的󰀁-甘露聚糖酶基因已被克隆,并经序列分析,如嗜碱芽孢杆菌AM-001、极端嗜热厌氧菌、专性嗜热厌氧菌、荧光假单孢菌、弧菌、嗜冷菌等细菌,以及变青链霉菌、里氏木霉梭菌、曲霉等真菌。󰀁-甘露聚糖酶基因工程方面的研究已有成功报道,不同来源的󰀁-甘露聚糖酶基因分别在原核表达系统和真核表达系统中进行了表达,在大肠杆菌表达系统表达的󰀁-甘露聚糖酶主要证明酶基因的活性功能,而在酵母系统中表达的蛋白在糖基化、磷酸化等方面的优越性远高于在大肠杆菌中的表达。迄今报道酶活力最高的是丁宏标筛选得到的高效分泌󰀁-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌MAN22,在5L发酵罐发酵酶活力可达1100000u/mL[20]。6󰀁󰀁-甘露聚糖酶的应用6󰀁1󰀁食品和医药甘露低聚糖是󰀁-甘露聚糖酶作用于多糖类物质后产生的功能性低聚糖,这种低聚糖可有效地降低人体胆固醇水平,降低血糖;有利于人体或动物肠道有益菌群(双岐杆菌、乳酸菌)的生长,抑制有害菌的繁殖,从而改善人体肠道功能;降低病原菌的致病力;结合吸收外源性病原菌;调节机体免疫系统,增强动物以及人体免疫力。多用做保健品、食品的加工和储藏和饲料添加剂。另外,󰀁-甘露聚糖和󰀁-甘露聚糖酶对动物健康和生产性能的促进作用某种程度上已成为抗生素的替代产品,长期使用甘露低聚糖可防止沙门氏菌、肉梭状芽抱杆菌等致病菌的感染、在肠道的繁殖和定植,减少抗生素的添加量[21]。6󰀁2󰀁应用于造纸、印染和石油工业在造纸工业中,󰀁-甘露聚糖酶和󰀁-木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用,处理纸浆,能明显改善纸质。将󰀁-甘露聚糖酶运用纺织印染和纸浆的漂白工艺中,能有效地去除产品上粘附的多余染料,更可以减少氯和碱的用量以及它们带来的环境污染问题[4]。中科院微生物研究所、辽河油田井下作业公司和山东沂水酶制剂厂联合将󰀁-甘露聚糖酶制剂用于低温油井破胶,也取得了突破性进展,具有效率高,成本低,适用范围广、对地层伤害小等优点,降低了能耗和对环境的污染。6󰀁3󰀁其它应用󰀁-甘露聚糖酶作为工具酶在糖工程、糖结构分析、植物基因工程等生物基础研究中有着重要用途,利用󰀁-甘露聚糖酶水解复杂糖类或糖蛋白的糖链中常有󰀁-甘露糖苷键,并测定水解产物中多糖类物质的种类和比例,可以对天然多糖类物质糖链结构进行分析。󰀁-甘露聚糖酶还可用于作竺麻的脱胶艺中,具松解纤维、降低竺麻纤维的残胶,提高精干麻品质的作用[22]。7󰀁结语随着近年来对自然界半纤维素资源的开发和甘露低聚糖药用价值的发现,针对󰀁-甘露聚糖酶的基础研究已进入一个新高潮。为使󰀁-甘露聚糖酶更广泛的应用于人类生活中,我们应继续从动植物和微生物中筛选更具有价值的󰀁-甘露聚糖酶,加深对其结构和功能的认识,根据实际生产的需要定向改造产酶菌株或构建外源高表达体系从而推动工业化推广应用。参考文献[1]󰀁DHAWANS,KAURJ󰀁Microbialmannanases:anoverviewofpro󰀁ductionandapplications[J]󰀁CriticalReviewsinBiotechnology,󰀁249󰀁黑龙江医药HeilongjiangMedicineJournalVol󰀁24No󰀁22011