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微生物鉴定细菌霉菌计数
微生物鉴定中细菌、霉菌的计数一般采用平皿法。
这是一种常用的计数方法，包括常规法和培养基稀释法。
在采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2~3个稀释级的供试液。
取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中（如果是培养基稀释法，则将1ml供试液均匀分注入2个或以上的平皿中）。
然后，注入15~20ml 温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，待其凝固。
通过这种方法，可以测定出供试品中的细菌、霉菌及酵母菌的菌数。
如需更多信息，建议咨询相关领域的专家或查阅相关文献。
食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数1 范围本标准规定了食品中霉菌和酵母（moulds and yeasts）的计数方法。
本标准适用于各类食品中霉菌和酵母的计数。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 培养箱：28 ℃±1 ℃。
2.2拍击式均质器及均质袋。
2.3 电子天平：感量0.1 g。
2.4 无菌锥形瓶：容量500 mL。
2.5 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。
2.6 无菌试管: 18 mm×180 mm。
2.7 旋涡混合仪。
2.8 无菌平皿：直径90 mm。
2.9 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
2.10显微镜：10×。
3 培养基和试剂3.1 生理盐水：见附录A中A.1。
3.2 马铃薯葡萄糖琼脂：见附录A中A.2。
3.3孟加拉红琼脂：见附录A中A.3。
4 检验程序霉菌和酵母计数的检验程序见图1。
图1 霉菌和酵母计数的检验程序5 操作步骤5.1 样品的稀释5.1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品，加入225 mL无菌稀释液（水或生理盐水），充分振摇，或用拍击式均质器拍打2 min，制成1:10的样品匀液。
5.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品至盛有225 mL无菌稀释液（水或生理盐水）的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或无菌均质袋中，充分振摇或用拍击式均质器拍打2 min，制成1:10的样品匀液。
5.1.3 取1 mL 1:10样品匀液注入含有9 mL无菌稀释液的试管中，另换一支1 mL无菌吸管反复吹吸，或在旋涡混合仪上混匀，此液为1:100的样品匀液。
5.1.4 按5.1.3操作程序，制备10倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次，换用1支1 mL无菌吸管。
5.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液于2个无菌平皿内。
霉菌检测的原理霉菌检测是指通过特定的方法和技术来鉴定和测量环境中是否存在霉菌，并评估霉菌的种类和数量。
霉菌是一类广泛存在于自然环境中的微生物，可以生长在各种有机物质上，包括食物、土壤、空气和建筑材料等。
生活中的霉菌虽然看起来微小无害，但实际上其孢子和代谢产物可能对人类健康造成负面影响，如过敏反应、呼吸道感染和毒性效应。
因此，及早进行霉菌检测和控制对于保护人类健康和环境卫生至关重要。
霉菌检测的原理主要包括采集样品、孵育培养、观察鉴定和计数测量等步骤。
首先，需要选择适当的采样点和方法来收集环境样品，如表面拭子、空气采样器、液体培养基和分生技术等。
然后，将采集的样品放置在适宜的培养基上，提供适当的温度、湿度和营养条件来促进霉菌孢子的萌发和生长。
培养一段时间后，利用显微镜观察和鉴定不同形态的霉菌菌落，如颜色、形状和纹理等特征。
同时，也可以利用分子生物学技术，如PCR扩增和DNA测序等方法，对霉菌进行基因分析和鉴定。
最后，可以使用计数板、显微镜、光学密度法或培养液细胞数等方法来测量霉菌的数量和浓度，从而评估霉菌的污染程度和危害程度。
在霉菌检测中，有一些常用的培养基被广泛应用于分离和鉴定霉菌，如马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、玉米麦芽琼脂（CMA）、培养基盒（MEA）和马尔霉菌球蛋白琼脂（DG18）等。
这些培养基富含丰富的营养物质和适宜的pH值，能够满足霉菌的生长需求，并便于观察和鉴定。
除了传统的培养和观察方法外，现代技术也被广泛应用于霉菌检测中，如荧光显微镜、流式细胞术、DNA探针和高通量测序等。
荧光显微镜可以利用特殊的染色剂和荧光探针来标记霉菌细胞或代谢产物，从而在显微镜下进行可视化观察和鉴定。
流式细胞术是一种基于细胞的悬浮液通过激光束逐个通过细胞计数器进行检测和测量细胞数量、大小和形态等特征的技术。
DNA探针可以通过与霉菌DNA序列的互补配对来标记和检测霉菌的存在和数量。
高通量测序技术可以通过对环境样品中霉菌DNA进行大规模测序分析来鉴定和定量霉菌的组成和种类。
实验八食品中霉菌计数法食品中的霉菌计数法及其实验方法引言：食品中的霉菌，是食品卫生与安全的一个重要指标。
霉菌孳生繁殖，会产生许多毒素，对人体健康造成危害。
因此，了解和掌握食品中霉菌的计数方法，对于保障食品安全具有重要意义。
本文将介绍食品中霉菌计数法以及相关的实验方法。
一、霉菌的定义和分类霉菌是一类简单的真菌，主要以孢子繁殖。
霉菌分为好霉菌和致病霉菌两大类。
好霉菌可用于发酵食品的制作，如酱油、豆豉等，具有食用价值；致病霉菌则会产生毒素，严重时可导致食物中毒。
二、食品中霉菌计数法食品中霉菌计数的主要方法有直接计数法和表面均匀涂布法。
1. 直接计数法直接计数法是将食品样品进行适当的稀释后，通过显微镜下观察计数霉菌孢子的数量。
具体步骤如下：（1）准备所需实验材料和设备，包括显微镜、玻璃片、移液管、无菌培养基等。
（2）取少量食品样品加入适量的无菌水中，制成一系列的稀释液。
（3）将稀释液取适量滴于玻璃片上，覆盖另一块玻璃片，用显微镜观察计数霉菌孢子的数量。
（4）根据观察结果计算出食品样品中霉菌数量。
2. 表面均匀涂布法表面均匀涂布法主要是将食品样品均匀地涂布在培养基表面，使霉菌孢子落在培养基上形成菌落。
具体步骤如下：（1）准备所需实验材料和设备，包括培养基、无菌针筒、平板培养皿等。
（2）将食品样品取适量，利用无菌针筒将样品均匀涂布在培养基的表面上。
（3）将培养基培养皿倒置，放置在适当的温度下，培养一定的时间，使霉菌孢子发芽和生长。
（4）观察培养皿上的霉菌菌落数量和形态。
三、实验注意事项在进行食品中霉菌计数实验时，需要注意以下事项：1. 实验过程要保持无菌环境，以避免外界的干扰和污染。
2. 要选择适当的培养基和培养条件，以促进霉菌的生长，保证实验结果的准确性。
3. 实验结束后，要对实验器材进行彻底的清洗和消毒，避免交叉污染。
4. 实验过程中，要注意个人的安全防护，避免吸入或接触有害物质。
5. 实验结果应根据食品卫生标准进行评价，以判断食品是否符合卫生要求。
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液的制备和使用（以白色念珠菌为示例）白色念珠菌（0）代↓传代培养↓实验菌液的制备：沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20～25℃，培养时间2～3天↓计数培养基适用性检查：胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu↓计数方法适用性试验：胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu 注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
1.2菌液制备（按表1规定程序培养各试验菌株）取白色念珠菌的新鲜培养物↓用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液取黑曲霉的新鲜培养物↓加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱↓采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
1.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
2.培养基适用性检查按表1规定，接种不大于100cfu的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表1规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好3计数方法适用性试验供试液制备：水不溶性非油脂类供试品↓取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基↓制备成1:10供试液。
霉菌数的测定
一、供试液的制备
用开空面积为20cm 2的消毒过得采样板压在试样的内层面上，将无菌棉签在无菌生理盐水中稍沾湿，在板孔范围内擦抹5次，换一支再擦5次，共擦抹5个位置100cm 2
,10支棉签，每个棉签擦抹完后将头折断投入盛有30ml 无菌生理盐水的三角烧瓶中。
全部投入后，将烧瓶迅速摇晃1分钟，静置10分钟，即得1:1供试液（原液）。
二、培养基、试剂制备
1、 虎红琼脂培养基
按所需称虎红琼脂干粉，加蒸馏水充分溶解。
经121℃15—20分钟高温灭菌，冷至45℃倾注平皿。
2、 生理盐水
称取0.9g 氯化钠加100ml 蒸馏水，摇匀即可。
溶解分装后于121℃20分钟高温灭菌。
三、检验程序
四、菌落数报告 制备
1:10供试液 1:1000供试液 供试品
1:100供试液
稀释 稀释
2—3个 2—3个
2—3个
注 皿
养
菌落计数 报 告 23—28℃ 72h
1、一般宜选择菌落数在30—100间的稀释级，作为菌落计算的依据。
2、若相邻的2个稀释级的平均平板菌落数处在30—100时，计算级间比值。
当比值≦2时，
以两级菌落数的均值为报告菌数；当比值>2时，按低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。
3、各稀释级的平均菌落数均不足30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌
数。
注：报告数值取2位有效数字。
韩国检测霉菌的方法是Howard霉菌计数法（Howard Mold Counting Assay）。
其方法如下：
1.所需设备
1)高速混合器
可调速的高速混合器，4-8个尖锐的不锈钢刃在200ml容量的不锈钢杯容器的底部附近旋转，使用旋转速度最少0~10，000rpm之间，并用带有旋转速度仪的高速混合器。
2)Howard霉菌计数玻片（Howard Mold Counting Slide）
依外壕被围绕的20×15mm大小的四角的玻璃片。
试料点滴平面的两个侧面盖玻片支架比试料点滴平面高出0.1mm的整齐突起。
盖玻片放在支架上面时，使用试料点滴平面与盖玻片之间的深度达到0.1mm的玻片。
3)显微镜
使用配有4个黑白接物镜并以10-400倍的倍率可以观察的显微镜。
2.试剂
1）1%氢氧化钠溶液（NaOH）
2）氧化硅胶液小包制或者2-辛醇（2-octanol）
3）稳定液（5%果胶溶液）：高速搅拌器里注入475ml、85℃水搅拌的同时将25g的果胶（pectin）少量的添加并溶解。
3．试验操作
1）试验溶液的调配
称5g检样放入高速混合器。
100ml的1%氢氧化钠溶液分2
次添加，第一次添加约30ml在10，000rpm的速度下搅拌5秒，然后用余下的70ml清洗混合器内壁上的附着物。
把混合器内的混合物以10，000rpm的速度搅拌3分钟后，滴入氧化硅胶液3~4滴除去泡沫，以上的混合物100g与25g的稳定液混合作为显微镜镜检试料。
2）试验操作
（1）显微镜镜检试料的操作
Howard霉菌计数玻片的试料平面上利用滴管点滴试料。
在点滴的试料上，大的检样片或籽等用微型镊子取出后，尽量不产生斑点或线条的小心放上盖玻片，然后在显微镜载物台上插入霉菌计数玻片。
（2）霉菌菌丝的诊断
在显微镜的100~450倍观察时，霉菌菌丝有下列外观特性。
★细胞壁的平行
★分节
★形成粒子
★分枝
★菌丝的末梢
★非折射性的外观
（3）阳性划区判定
对一个可视划区判定阳性或者阴性。
哪一个划区也不能一次以上的判定阳性。
为判定一个划区为阳性，三根以下的霉菌菌丝的总长度（合计长度）需要超过可视划区直径的1/6.大部分的阳性划区判
定是包括分枝长度的一个菌丝的长度为依据，并且要超过可视划区直径的1/6。
下列长度中只要有一个超过可视划区直径的1/6，该可视划区判定为阳性。
●没有分枝的一个菌丝的长度
●分枝的长度合计的一个菌丝的长度
●2个菌丝的长度合计的长度
●3个菌丝的长度合计的长度
●由霉菌块形成的所有菌丝的总长度(霉菌块是作为1个碎片来
看待并且所有菌丝的总长度)
（4）显微镜镜检
适当的调整粗调螺丝和微调螺丝，在90~125倍的倍率范围里，调准焦距到可视划区内的物体能够清晰可见。
在试料平面上设定25个圆型的可视划区，按号码顺序判定霉菌菌丝体的各可视划区的霉菌菌丝体是阳性或者阴性。
从1号可视划区到25号可视划区逐一镜检，按各可视划区分别判定霉菌菌丝体的阳性或者阴性。
从1号到25号划区的镜检结束后，从显微镜拿出Howard霉菌计数玻片清洗干燥。
使用同一试验溶液反复（1）的试验操作，从25号划区起至1号划区逐一实施镜检，对总共50个可视划区判定阳性或者阴性。
（5）计算
观察的所有划区镜检的结果被判定为阳性的划区的比率%
（阳性的可视划区/镜检的总可视划区数）×100=阳性比率%。
