IEc介导志贺菌的头孢菌素抗生素耐药的分子机制研究可编辑
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ISEcp1介导志贺菌头孢菌素抗生素耐药的分子机制研究ISEcp1 介导志贺菌头孢菌素抗生素耐药的分子机制研究#1,211,31**510152025303540(1. 郑州大学公共卫生学院,郑州 450001;2. 河南科技大学医学院,洛阳 471003;3. 新乡医学院公共卫生系,新乡 453003)摘要:目的研究头孢噻吩诱导前后志贺菌 ISEcp1 与 blaCTX-M 基因的位置关系及其在志贺菌 CTX-M 超广谱β-内酰胺酶表达中所起的作用。
方法用头孢噻吩的次抑菌浓度对临床分离鉴定的志贺菌进行诱导耐药试验。
对志贺菌出发株及诱导耐药株的ISEcp1、blaCTX-M 进行聚合酶链反应PCR。
采用 PCR-mapping 及 DNA 测序分析比较其诱导耐药前后 ISEcp1 与blaCTX-M 的位置关系差异。
将 PMD19-T 空载体、该志贺菌 CTX-M 基因全长,及前述PCR-mapping 获得的包含ISEcp1 下游及CTX-M 基因全长的片段即ISECTX 片段)分别与 T载体连接转化到大肠杆菌感受态细胞 DH5α中得到 DH5αT、DH5αCTX和DH5αISECTX。
RT-PCR 观察 DH5αCTX和 DH5αISECTX的 blaCTX-M 基因表达水平差异。
药敏试验观察各克隆株的耐药性差异。
结果成功获得志贺菌诱导耐药株,该诱导耐药株对头孢噻吩高水平耐药。
志贺菌敏感株和诱导耐药株 PCR 扩增均扩出 ISEcp1 和 blaCTX-M 且为 CTX-M-1 亚组blaCTX-M-55,但只有诱导耐药株 blaCTX-M 基因上游存在 ISEcp1 插入序列。
测序发现此插入序列为 blaCTX-M 基因提供启动子-35 及-10 位点及 1 个右反向重复序列(转位酶识别位点)。
DH5αISECTX较 DH5αCTX的 CTX-M 超广谱β-内酰胺酶表达水平高,且该克隆株对头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛钠、头孢吡肟的耐药性较强。
结论在外界头孢噻吩抗生素压力下,敏感志贺菌中 ISEcp1 可转座到 blaCTX-M 基因上游并使下游blaCTX-M 基因高水平表达,导致对头孢菌素耐药。
关键词:流行病学;志贺菌;耐药;ISEcp1;blaCTX-M中图分类号:R378.2Study on the molecular mechanism of ISEcp1 involved incephalosporin resistance in ShigellaWang Yingfang1,4, Yang Haiyan2, Duan Guangcai1,5, Xi Yuanlin31. College of Public Health , Zhengzhou University , Zhengzhou, 450001;2. Colledge of Medicine, Henan University of Science and Technology, Luoyang, 471003;3. College of Public Health , Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003;Abstract: Objective To compare the location of ISEcp1 in Shigella flexneri before and after inducedby CephalothinCF, and study the relationship between the CTX-M extended spectrum beta-lactamaseexpression. Methods Clinical shigella flexneri strain was induced into anti-drug strain by 1/2 MICinduced trails of CF. ISEcp1 and CTX-M were amplified by polymerase chain reactionPCR inoriginal strain and induced anti-drug strainPCR-mapping was used to detect blaCTX-M, ISEcp1 andanalyze their relatioship. The PCR products were sequenced and compared. The complete blaCTX-Mand the ISECTX included downstream of ISEcp1 and the complete blaCTX-M were inserted in aT-vector and transformed into DH-5α which were named DH5αCTX and DH5αISECTX. Theexpressing levels of blaCTX-M in DH5αCTX and DH5αISECTX were detected by RT-PCR.Sususceptibility tests were performed in the two clones. Results Induced anti-drug strain of shigellaflexneri was obtained successfully. It is resistant to cefalotinCF at a high level. ISEcp1 andblaCTX-M-55 were found in original strain and induced anti-drug strainblaCTX-M-55 was flank基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金博导类(编号:207)作者简介:王颖芳1977.3-,女,讲师,博士研究生,分子流行病学通信联系人:段广才1958.8-,男,教授,分子流行病. E-mail: gcduan@//0>.-1-45505560upsream by an ISEcp1 element provide a right inverted repeat IRR recognized by transposase; -35and -10 promoter sequences may drive the expression of blaCTX-M gene at a high level. Theexpressing levels of blaCTX-M in DH5αISECTX was higher than DH5αCTX. The antibioticresistances of DH5αISECTX to ceftotaximeCTX, ceftriazoneCRO,cefurosimic sodiumCXMand cefepimeFEP were higher than DH5αCTX. Conclusion ISEcp1 element could translocateupstream of blaCTX-M in S. flexneri following induction by cephalothin. ISEcp1 may drive theexpression of the balCTX-M geng at a high level in Shigella spp.Key words: Epidemiology;Shigella flexneri; drug resistance; ISEcp1; blaCTX-M0 引言由于具有广谱抗菌活性的头孢菌素大量使用,造成了产超广谱β-内酰胺酶(extendedspectrum beta-lactamase,ESBLs)细菌在世界范围内的流行。
CTX-M 型属于非 TEM 和 SHV型 ESBLs,此类酶可水解头孢菌素,其抗菌活性可被克拉维酸所抑制[1]。
CTX-M-ESBLs 按照氨基酸相似性划分为 6 个亚组,即 CTX-M-1、CTX -M-2、CTX -M-8、CTX -M-9、CTX -M-25和 CTX -M-45 组,迄今发现 140 余种。
近年来通过对 CTX-M-ESBLs 周围的“基因环境”进行研究,发现位于 blaCTX-M-like 上游的的插入序列 ISEcp1 可能对其表达和水平传播起重要作用[2,3]。
目前志贺菌中 ISEcp1 在产 CTX-M 超广谱β-内酰胺酶志贺菌耐药中的作用尚不清楚。
本研究旨在探讨志贺菌中插入序列 ISEcp1 与 CTX-M 型超广谱β-内酰胺酶与的关系,及其在产 CTX-M 超广谱β-内酰胺酶志贺菌耐药中的作用。
1 材料与方法651.11.1.1材料菌株1.1.1.1 大肠埃希菌 ATCC-25922(药敏实验标准控制菌)购自河南省临床检验中心。
1.1.1.2 志贺菌出发菌株 mel-sf1998023/zz:采用改良 K-B 纸片法筛选一株对头孢噻吩(Cephalothin ,CF)、诺氟沙星(Norfloxacin,NOR)、庆大霉素(Gentamycin,GM)、70磺胺甲基异恶唑(Cotrimoxazole,SMZ)均敏感的福氏志贺菌。
临床分离鉴定的野生志贺菌出发菌株 mel-sf1998023/zz 来源于郑州大学第三附属医院。
1.1.2试剂SS琼脂、EMB琼脂、营养琼脂、水解酪蛋白(Mueller-Hinten,MH)琼脂产自上海市医学化验所。
各种琼脂平板在本实验室按配方配制。
头孢噻吩为标准品,购自中国药品检验75中心。
PCR相关试剂购自北京天根生化科技有限公司。
药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。
感受态细胞DH5α购自郑州创生生物工程有限公司。
pMDl9-T载体购自TaKaRa公司。
DNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
TRIzol 购自Invitrogen公司。
1.1.3引物80由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
-2-1.1.3.1 插入序列 ISEcp1 引物[3]: P15'-GCAGGTCTTTTTCTGCTCC-3' , P25'-TTTCCGCAGCACCGTTTGC-3'扩增片段长度为527bp,退火温度为58℃。
1.1.3.2blaCTX-M 引物[4]: P35'-CTTCCAGAATAAGGAATCCCAT-3',P45'-CCCATTCCGTTTCCGCTA-3' 扩增完整的blaCTX-M基因,扩增片段长度为914bp,退85火温度为56℃。
