广东省高教厅重点实验室——现代生物技术实验室教材酶工程实验技术华南农业大学广东省教育厅现代生物技术重点实验室酶工程分室2007年11月编者的话华南农业大学现代生物技术实验室酶工程分室是由广东省高教厅和华农大投资建设的教学提高型实验室，面向石牌地区六所高校的高年级本科生及硕士、博士研究生开设《酶工程实验技术》课程。
该课程以实验为主，为保证学生在修读本课程时有较好的理论基础，要求所有学生预修“酶工程与蛋白质工程”。
本课程实验内容分酶源的获取、酶制剂分离纯化及分析鉴定、酶制剂的体外改造、酶制剂的应用和酶基因的重组表达五大部分，具体如下：为满足课程教学的需要，经反复修改，特编写了本实验教材。
本实验指导的编写由王炜军，郭振飞，方颖、刘娥娥老师参加编写，在此一并表示感谢！本实验指导为试用第五版，试用后我们将根据各校修课的情况作进一步修改，敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。
编者2006年11月实验一、产淀粉酶菌株的快速筛选一、目的学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。
二、原理产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV-淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。
而透明圈直径与菌落直径之比则可反应菌落分泌淀粉酶能力的高低。
本方法有快速、简单易行等优点。
图1 产淀粉酶菌落形成的透明圈三、材料、试剂和仪器1、菌的来源取不同地点的表层土壤。
2、试剂：RBV-Starch（Sigma）, NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl, 2 mol/L NaOH 无菌水和琼脂粉等。
3、器皿250mL三角瓶两个、9.0cm培养皿若干、涂布棒、200µL移液枪、200µL枪头若干、牙签若干、指形管若干、10mL具塞刻度试管四支、滴管四支、取样器和塑料直尺等。
4、仪器设备高压消毒锅、恒温通气式培养箱、摇床、离心机、电子天平等。
四、实验操作步骤1、器皿的消毒：培养皿、枪头、牙签、指形管、塞刻度试管、滴管四支等用四层报纸包好，在121℃下灭菌20 min，取出备用。
2、培养基的配制与灭菌培养基的组成为：RBV-淀粉（1.2 %, w/v），NaNO3(0.2%, w/v), K2HPO4( 0.2 %, w/v) , MgSO4·7H2O （0.1%, w/v）, KCl(0.1%, w/v), 琼脂（2% , w/v）, 调PH至6.0左右。
在三角瓶中，121℃灭菌20 min，将灭菌后的培养基倒入培养皿，每皿大约15mL，静置凝固备用。
（倒平板之前务必将培养基摇晃均匀，以避免标记的RBV-淀粉在培养基中分布不均匀，影响菌落的观察。
）3、土样的采集及稀释于校园等不同地点采集土壤样品；取样时，用取样器向下打取1cm左右深度的土样，将从各个地点取得的土样混合；取样点最好选择有机质丰富的地方。
4、富集称取5.0 g混合土样和0.5 g的淀粉混合，并加入适量的蒸馏水使其湿润，置于培养皿中富集培养24h。
5、菌种的初筛称取1.0g步骤4所得的土样于灭菌具塞刻度试管中，在超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成），加入无菌水至5mL，振荡后静置，待土壤颗粒沉降后，取上层液1mL转移至另一刻度试管中，加入9mL无菌水，摇匀；从第二支试管中取出1mL转移至第三支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀；再从第三支试管中取出1mL转移至第四支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀。
如此重复即得到稀释倍数分别10、100、1000倍的土壤稀释液。
用移液枪分别吸取稀释100和1000倍的样品液50 µL，加入至已凝固的培养基表面，用涂抹棒涂布均匀。
将涂过样的培养皿倒置放置，于30℃培养箱里培养，观察菌落透明圈的出现情况。
（一般30h 后即可出现一些透明圈）。
6、菌株的纯化于超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成）用接种环挑取长势良好且透明圈直径与菌落直径的比值较大的菌落于平板上划线分离，培养一定时间，进一步分离能形成透明圈的单菌落。
并在斜面培养基中保存。
图 2 平板划线分离法示意图五、结果处理与分析1、菌落产生透明水解圈的观察用直尺分别于不同方向测量菌落和水解圈的直径大小，求平均值，并计算透明水解圈直径与菌落直径的比值。
表 1 不同菌落产淀粉酶能力的比较菌落编号菌落直径（mm）透明圈直径(mm) 透明圈直径/菌落直径菌落形态特征2、侯选菌落的形态观察：观察并描述分离所得菌株的菌落形态，以大致了解产酶菌株属于那一类菌。
3、你所用的涂布平板法或划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是请分析原因。
六、注意事项1、进行无菌操作前，将接种所需用具放于台面铁架上，对超净工作台即周围环境进行75％酒精喷雾，使灰尘沉降，打开紫外灯照射灭菌30min，操作前，用75％酒精喷手杀菌。
（在本实验中省去此步）。
2、操作应尽量靠里，在酒精灯的火焰旁工作。
3、实验过程中避免说话、走动。
4、每次涂板后涂布棒皆要用火焰灼烧灭菌，冷却后再涂下一块板。
实验二、鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离一、目的学习和掌握亲和层析法分离纯化酶的基本原理和方法。
二、原理许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地特异结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。
如：酶和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合，特异性的抗体一抗原（包括病毒、细胞）、激素与其受体、载体蛋白的结合，基因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。
均属于专一性而可逆的结合，这种分子之间的结合能力叫做亲和力。
亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。
所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。
它具有分离快速，纯化效率高。
特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。
因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。
磁性介质被广泛用于分离细胞、核酸蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质，其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其它固形物间的分离，尤其是当待分离的液体样品含有其它固形物或粘度较大时。
磁性亲和分离技术是将亲和吸附的专一性、高效性与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新型分离技术。
溶菌酶（Lysozyme, EC.3.2.17）广泛地存在于动物、植物和微生物中，其中鸡蛋清中的含量较为丰富。
鸡蛋清溶菌酶的相对分子质量为14.6 KD，由129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白，含有4个S-S键，在中性及偏酸性条件下结构较为稳定。
溶菌酶能催化水解细菌细胞壁多糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键，几丁质（又称甲壳素）则是这类细胞壁多糖的类似物，因此可利用溶菌酶与甲壳素间的特异结合来分离纯化溶菌酶。
三、材料、试剂及仪器1、材料● 新鲜鸡蛋清：取自市售的鸡蛋。
● 亲和层析介质：几丁质磁性凝胶介质（自制）。
● 溶壁微球菌（Micrococcus Lysodeikticus）（Sigma公司）2、试剂● 0.15N HAc ：吸取18mL冰乙酸，定容至1000 mL。
● 10%的HAc：吸取100mL冰乙酸，用蒸馏水定容至1000 mL。
● 0.2mol/L NaHCO3溶液：称取16.8g NaHCO3，溶解，定容到1000mL。
● 5mmol/L NaHCO3溶液（含0.2 mol/L NaCl）：先将0.2mol/L NaHCO3稀释40倍，再于每升溶液中加入NaCl 11.688g。
● 5mmol/L NaHCO3溶液（不含NaCl）：将0.2mol/L NaHCO3稀释40倍。
● 10mmol/L NaHCO3溶液：将0.2mol/L NaHCO3稀释20倍。
● 1/15 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.2）：Na2HPO3·12H2O 4.7752g，KH2PO4 7.2576g，溶解，定容至1000mL。
● 考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝溶于50mL 90%乙醇，加入85%磷酸100mL，用蒸馏水定容至1000mL，过滤。
● 2 mol/L NaOH ：称取80g的NaOH定容至1000 mL。
●0.1mol/L pH 7.8磷酸缓冲液(内含0.5mol/L NH4Ac)：称取32.78 g 的Na2HPO3·12H2O，1.33 g的NaH2PO4·2H2O, 38.54 g的NH4Ac溶解后，定容至1000mL.3、仪器分部收集器、分光光度计、恒温水浴器、恒流泵、电子天平、强力电动搅拌器、抽滤装置。
四、操作步骤（一）、鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离1. 亲和层析介质的再生和平衡：用3-4个床体积的5mmol/L NaHCO3（含NaCl）溶液淋洗亲和层析介质即可。
（若发现介质上有太多杂蛋白和一些微生物污染，可用0.5mlo/L的NaOH淋洗亲和层析进行在位清洗）2.蛋清提取液的制备：取一个新鲜鸡蛋的蛋清，用5mmol/L NaHCO3 （不含NaCl）液搅匀并稀释至400mL，双层尼龙布过滤，取滤液。
（测定酶液总体积，并留1.0 mL样品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的测定）。
3.酸和热变性：用10%的HAc将稀释后蛋清的pH值调至4.5，60℃水浴15分钟，双层尼龙布过滤，取滤液，用2 mol/L的NaOH将上清的pH值调回至7.0（边缓慢加入NaOH边搅拌，以免局部溶液pH值过高和将pH值调过头），（测定酶液总体积，并留1.0 mL样品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的测定）。
4.开放吸附：向步骤3的上清液中加入上述平衡好的磁性凝胶介质，于烧杯中用玻棒缓慢搅拌30 min（见图1-1）。
（尽量缓慢地搅拌，以免破碎凝胶颗粒）。
在此步骤中溶菌酶被亲和吸附到凝胶介质上。
5.介质的磁性回收及洗涤：用带环型条纹塑料外套的圆形铁氧体磁铁作为外磁场收集亲和介质，此时介质被吸附于塑料外套的表面，取出塑料外套中的磁铁将吸附于塑料外套的表面的介质悬浮于10mmol/L NaHCO3溶液中，缓慢搅拌洗涤介质，磁性回收，如此洗涤介质2次（见图1 –2,3）。
将洗涤后的介质装柱（测柱径及层析床的高度），再用pH 7.8 含0.5mol/L NH4Ac 的0.1mol/L 磷酸钠盐缓冲液(以下称溶液B)洗涤至流出液的A280< 0.05时，再用10mmol/L NaHCO3溶液20mL洗涤以替换柱子中的溶液B，以便下一步的洗脱操作。
