基因打靶

基因打靶基因打靶研究背景显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的。

可能导致下面几种情况出现：1导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺失；2导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；3外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；4导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。

解决办法：将外源基因导入预先确定的位点。

即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶。

什么是基因打靶基因打靶(gene targeting)技术也称为基因定点同源重组，是利用基因转移方法, 将外源DNA序列导入靶细胞后, 通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上的同源DNA序列间的重组, 将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点, 或对某一预先确定的靶位点进行定点突变, 从而改变细胞遗传特性的方法。

它是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。

尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。

基因打靶原理生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。

同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。

ES细胞是一类具有在体外培养件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。

首先获得ES 细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES 细胞。

通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES 细胞引入受体胚胎内。

经过遗传修饰的ES 细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。

获得的带有特定修饰的突变动物提供研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。

目前，在ES 细胞进行同源重组己经成为一种对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。

通过基因打靶获得的突变小鼠己经超过千种( 相关数据库参见文献) ，并正以每年数百种的速度增加。

通过对这些突变小鼠的表型分析，许多与人类疾病相关的新基因的功能已得到阐明，并直接导致了现代生物学研究各个领域中许多突破性的进展。

基因打靶的主要步骤重组基因载体的构建导入受体细胞筛选检测打靶载体的构建基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等。

1、基因打靶载体：基因插入型载体(Gene-insertion vector)：插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的功能。

基因置换型载体(Gene —replacement vector)：置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线性化后，同源重组使染色体DNA 序列为打靶载体序列替换。

大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。

2、外源DNA 导人的方式外源DNA 导人的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。

目前应用最广的是显微注射法。

显微注射每次只能注射一个细胞；电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。

Mansour 等研究发现电穿孔可使1％的ES 细胞稳定转染；逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。

3、基因打靶的筛选方法（1）正负双向选择系统(positive-negative-selection, PNS)解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。

同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。

随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。

正选择基因多为neo 基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。

负选择基因常用HSV-tk 基因，在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，a 在同源重组时，tk 基因将被切除而丢失，b 在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk ）无毒的丙氧鸟苷（GANC ）−−−−−→−）胸苷激酶蛋白（TK 毒性核苷酸 杀死细胞 筛选排除随机整合的细胞株。

a 同源重组时，G418和GANC 都有抗性，b 随机整合时对G418有抗性，但对GANC 敏感，细胞将被杀死，c 无整合的将被G418杀死。

用G418作正筛选，选出含有neo 基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk 基因的细胞株，保留未含有tk 基因的同源重组细胞（2）正相选择法（positive selection method ）主要程序：将标记基因neor 的启动子和起始密码剪切掉，再嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染进靶细胞，可能出现下面几种情况：①打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失；②外源打靶序列随机整合，由于neor 基因缺失了其自身的启动子和起始密码，整合位点周围亦无启动子，使neor 基因的表达受阻；③虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子能启动neor基因的表达；④外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor 基因可借助靶基因自然存在的启动子和起始密码的作用而呈现表达活性。

因此，如用G418筛选，则抗性细胞中将只包含后两种可能情况，根据这两种情况下基因组DNA酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交即可检测出同源重组的克隆。

4、基因打靶的策略（1）完全基因剔除(complete knotk-out)的策略借助于阳性选择标记基因通常被插入靶基因功能最关键的外显子中，或通过同源重组删除靶基因最重要的功能域，实行靶基因的完全剔除。

阳性选择标记基因常采用β-半乳糖苷酶基因（lacZ），将其以正确的读框插入靶基因的外显子中，除了剔除靶基因外，通过分析β-半乳搪苷酶的活性可以研究靶基因表达的时空顺序。

（2）大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping)可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来。

中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。

在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES克隆。

但此方法的缺点是只能剔除在ES细胞中表达的基因。

（3）精细突变的引入a打了就走策略(Hit and Run 法)这一方法包括两次同源重组：第一步（Hit）用插入型载体进行同源重组，这样会在靶位点插入带有突变的基因组序列以及载体骨架，载体骨架上带有两个筛选标记（如正筛选标记基因neo和负筛选标记基因tk）。

第二步（Run）利用tk抗性筛选，富集为数不多的发生了染色体内重组的克隆。

染色体内重组去除了含有负筛选标记基因的载体序列，由于负筛选标记基因的消失，细胞就恢复了对负筛选药物的抗性，因此，回复突变体可以在负选择培养基中存活下来。

b双置换法双置换法(double replacement)也属于精细突变敲除。

它首先用含有坳心基因的打靶载体转染坳聪一ES细胞，通过在次黄嘌呤、氨喋呤和脱氧胸腺嘧啶苷(hypoxanthine，aminopterin and thymidine，HAT)培养基中筛选并用PCR进行基因组分析，筛选发生同源重组、ttprt基因阳性克隆。

然后用只携带突变同源序列的打靶载体转染上一步获得的坳厅+Es细胞。

同源重组发生后，突变序列将印n 置换出来。

坳n一细胞可在6-巯基鸟嘌呤(6-thioguanine，6-TG)培养基上筛选并用PCR进行分析。

这种方法的优点在于，第一步获得的坳厅+Es细胞，除了可用于产生普通的基因剔除小鼠外，也可以作为将不同突变引入靶基因的基础。

Araya等在研究间隙连接蛋白43与骨骼肌的再生与分化的关系中构建的间隙连接蛋白43表达异常小鼠就是用这种策略。

c“标记和置换”法(tag and exchange)“标记和置换”法(tag and exchange)、重组酶介导的盒式交换法等也属于精细突变，它们与双置换法有许多共同之处。

“标记和置换”法是同源重组插入正负筛选标记基因(如lZeO，nprt，tk)对靶基因进行“标记”，然后用在同源序列上带有精细突变的载体来转染上一步得到的Es克隆，带有精细突变的同源序列将置换被“标记”的靶基因。

重组酶介导的盒式交换法是用重组酶将插入到基因组指定位点的基因盒与另一交换盒在重组酶作用下发生重组交换，来改变基因表型。

（4）条件性基因打靶条件性基因打靶(conditional gene targeting)可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因打靶方法。

它实际上是在常规的基因打靶的基础上，利用重组酶介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的―按钮‖，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

利用Cre／LoxP和来自酵母的FLP—frt系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。

通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP的(―loxP floxed‖)ES细胞产生―loxPfloxed‖小鼠，然后，通过将―loxP floxed‖小鼠与Cre转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。

在―loxP floxed‖小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故―1oxP noxed‖小鼠表型仍同野生型的一样。

但当它与Cre转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有―loxP floxed‖靶基因和Cre 基因。

Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP间发生切除反应，结果将一个loxP和靶基因切除。

这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre的表达为前提的。

Cre的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。

所以只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。

（5）诱导性打靶诱导性基因打靶就是以Cre/loxp系统为基础、利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性、从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因打靶技术。