转基因动物与动物生物反应器

动物乳腺生物反应器的原理及进展摘要：动物乳腺生物反应器技术是转基因技术的应用，于上世纪80年代提出，其目的是利用动物乳腺产生目的蛋白。

利用该技术生产的蛋白具有低成本，高活性，易提取纯化的优点。

虽然该技术尚处于发展时期，但具有广阔的应用前景和巨大地商业潜力，是许多公司大力发展的对象。

关键词：动物乳腺生物反应器、原理、进展、优点动物乳腺生物反应器（mammary gland reactor）是指利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并能从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。

1生物反应器(bioreactor) 经历了3 个发展阶段：细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。

细菌基因工程产物往往不具备生物活性,必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后, 才能成为有效的药物,而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻,成本太高,限制了规模生产。

动物生物反应器具有产品质量高,容易提纯的特点，弥补了其它各类基因表达系统的缺陷。

它是在转基因技术体系基础上发展起来的。

7自从上世纪80年代出现以来，已经取得了许多突破，现己成为生物技术研究的热点。

并向商业化阶段转变，显示了广阔的应用前景。

并且利用转基因动物乳腺生物反应器生产饮用奶，以期望获得既能满足蛋白质需要，又能增加抵抗力的品质全面的奶，为人类服务。

21、动物乳腺生物反应器的原理乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA 技术和转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。

1 外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。

它是一个专门化的分泌腺体，可以生产出具完全生物活性的药用重组蛋白质，其纯化简单，生产投资及成本相对较少，而且对环境不具污染性，也被称为“分子农场”。

转基因动植物生物反应器生物技术1002摘要:生物反应器，指以活细胞或酶为生物催化剂进行细胞增殖或生化反应提供适宜环境的设备，它是生物反应过程中的关键设备。

随着转基因技术问世,生物反应器不再局限于传统“冷冰冰”的设备，而是富有生命特性的动植物。

动植物生物反应器指的是通过基因工程途径以常见的农作物或者活体动物，高效表达某种器官或组织，进行工业化生产功能蛋白等生物制剂。

本文为大家阐述了转基因动植物反应器的优缺点，研究进展及其应用。

关键词:转基因动物反应器，转基因植物反应器，优缺点，研究进展，应用一、转基因动植物生物反应器的优缺点1.1转基因动物生物反应器的优点1易养殖，实现大规模制备。

2通过乳腺和血液制备活性物质简单易行。

3可以通过动物细胞培养实现大量制备。

4产量高，转基因动物在每升乳汁中可得几十克产物，而转基因植物，微生物在每升培养液中只能获得几毫克。

5成本低，用细菌、酵母菌或动物细胞生产基因工程药物，反应条件要求严格，而转基因动物只需要正常饲养。

6用于转基因动物制药的受体牛、羊、猪等哺乳动物，与人类亲缘关系比细菌、酵母菌要近的多，所以其产品具有与人体自身产生的蛋白相同的生物学活性川。

7用转基因动物培植活体器官和组织，用于更替人体患病的器官和组织。

1.2转基因动物生物反应器的缺点1细胞培养需要昂贵的培养基和设备。

2转基因动物制备成本昂贵。

3转基因动物易产生一些伦理问题。

4目前转基因动物的研究存在理论基础薄弱、技术不完善等问题"使得转入的基因在受体动物基因组中存在着随机整合、调节失控、遗传不稳定、表达率不高等问题。

为确保转入的基因能得到高效表达并完全整合，关键是基因构建和位点整合。

5转基因表达产物的分离与纯化也存在问题，可能会出现要纯化的产物含量低的现象，还要确保去除引起人类变态反应的非人类蛋白。

6转基因表达产物的结构和生物活性是否与人体蛋白相似#转基因产品必须与人体产生的蛋白高度相似，以免人体对它产生免疫反应。

动物乳腺生物反应器动物物乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。

乳腺生物反应器生产的外源蛋白种类广泛，从小分子肽到大分子复杂蛋白质，从生物活性酶到抗体、病毒抗原蛋白均可有效生产。

利用动物乳腺生物反应器生产重组蛋白的优点有：（1）生物活性高，无污染。

动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，从而保证了产品的高生物活性。

（2）易分离提纯，成本低廉。

现有的一些人药物蛋白之所以昂贵，除了原料难以收集外，另一原因是分离提纯极为困难成本极高。

而动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀乳清，再经层析即可得到重组蛋白，已经建立起完整的分离纯化生产程序。

（3）产量高。

外源基因在动物乳腺中的表达量可以达到每升几克到几十克，小群转基因大家畜的产量即可满足全世界市场的需求。

动物乳腺生物反应器已经成为生物技术领域最具开发应用前景的尖端方向。

动物乳腺生物反应器发展简史转基因动物的研究始于20世纪80年代初。

1980年，Gordon等将重组DNA用显微注射法导入小鼠受精卵原核，首次获得了整合有外源基因的小鼠。

1982年，Palmiter等将大鼠生长激素基因显微注射到小鼠受精卵中，首次获得了体重为正常小鼠2 倍以上的“超级小鼠”并提出了从转基因动物中提取药物蛋白的设想。

此后几年的许多研究奠定了转基因动物技术体系的基础，但真正的乳腺生物反应器研究则始于1987 年Gordon 等的工作，他们将组织型纤溶酶原激活剂（tPA）与小鼠乳清酸蛋白（WAP）基因的启动子构成重组基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表达tPA 的转基因小鼠，同年，世界上第一只能从乳汁中分泌α1-抗胰蛋白酶（AAT）的转基因绵羊在英国罗斯林研究所诞生。

从此，开始了乳腺生物反应器的实用性研究。

细胞工程学名词解释总结高技术：指那些能带来高经济效益、具有高增值作用，并能向经济和社会各领域广泛渗透的新技术。

生物技术：指通过技术手段，利用生物体或生物过程来生产有经济价值产品或创造新物种的综合技术。

狭义指基因重组、细胞融合、固定化酶与细胞、生物反应器等技术领域。

广义包括资源、能量、粮食、饲料生产以及为净化环境所进行的物质分解及发酵技术等。

细胞工程：是指以细胞为研究对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定细胞、组织产品或新型物种的综合技术。

生化工程：是由生物科学与化学工程相结合的交叉学科，研究生物技术的实验室成果转化为生产力过程的工程技术问题。

干热灭菌：指在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术。

主要适用于玻璃器皿的消毒灭菌。

湿热灭菌：湿热灭菌即高压蒸气灭菌，指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法。

（是最常用和最有效的一种方法。

布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭菌）。

细胞计数:用血球计数板计数细胞悬液中的细胞数目，然后根据需要进行必要的调整。

MTT法：又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

活细胞表现出线粒体脱氢酶活性，可将染料MTT还原为难溶的紫色结晶物沉积在细胞内，经酸性异丙醇溶解后呈现的色度可反映出生活细胞的代谢水平，而死细胞则无此酶活性。

活体染色：在体外条件下用某种染色剂对活的组织或细胞进行染色,而对活细胞的生理活动不产生任何明显的影响。

成集落试验：在集落刺激因子存在下培养细胞，可刺激培养细胞分化产生大小不同的细胞集落，这样的集落形成细胞称体外培养集落形成细胞，它是检验培养细胞能否增殖的过硬指标之一。

污染：一切与培养无关的杂质（微生物、化学物、细胞等）进入培养系统，影响培养物的正常生理机能。

动物细胞工程：以动物细胞为基本单位在体外条件下进行培养、繁殖和人为操作，使细胞产生某些人们所需要的生物学特性，从而改良品质，加速繁殖动物个体或获得有用品系的技术。

绪论1.细胞培养与组织培养：属于体外培养，是指生物细胞和组织在离体条件下的生长和增值。

细胞的离体培养称为细胞培养，组织的离体培养称为组织培养。

2.细胞融合：又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。

3.细胞核移植：是利用显微镜操作技术将细胞核与细胞质分离，然后再将不同来源的核与质重组，形成杂合细胞的过程。

4.干细胞：是动物体内具有分化潜能、并能自我更新的细胞，分为胚胎干细胞和组织干细胞。

5.转基因动物：是通过基因工程技术将外源的目的基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。

第一章1.细胞工程实验室与其他一般实验室的区别：要求保持严格无菌环境、避免微生物及其他有害因素的影响。

2.细胞工程能进行的六方面工作：无菌操作、培养、制作、清洗、消毒灭菌处理和储藏。

3.植物细胞工程实验室特殊的设置：光照条件的培养箱、试管苗需要温室和移植驯化室。

4.细胞工程实验室通用的仪器设备：超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、电热干燥箱、水纯化装置、低温装置、高压蒸汽消毒器。

5.实验室的生物安全分为p1，p2 ，p3 和p4四个生物安全等级，其中P4生物安全实验室等级最高。

第二章1.清洗的主要目的是清除培养器皿中的杂质和微生物等影响细胞生长的成分。

2.细胞培养过程中主要使用两类消毒方法:物理灭菌法法和化学消毒法。

物理法灭菌法：a.紫外线法适用于无菌室或超净工作台的台面等大面积消毒。

紫外线照射工作台面的距离不应超过1.5cm,照射时间以30min左右为宜。

（注意：紫外灯关闭5min后方可进入使用）b. 湿热消毒:适用于含有不耐热成分的培养基和试剂的消毒，为121.3℃，20min .（注意点：加足水、排尽气、气压降到0时才能打开盖）c.干热消毒法:适用于消毒玻璃仪器，160℃以上，并保持90~120min，以杀死细菌和芽孢 d.过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤,薄膜0.22~0.45um直径。

第十章动物染色体工程动物染色体倍性改造：染色体倍性改造工程是指有目的、有计划地增加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造动植物新品种的一项染色体工程技术，主要包括多倍体育种和单倍体育种。

染色体加倍技术：1、化学诱导方法：（1）秋水仙素：秋水仙素能抑制和破坏纺锤丝的形成。

因此，用秋水仙素处理正在分裂的细胞，可使染色体正常复制而细胞不发生分裂，从而形成同源多倍体的细胞。

（2）细胞松弛素B：通过抑制动物的肌动蛋白聚合成微丝，阻止细胞质的分裂。

（3）麻醉剂N2O等。

2、物理诱导法：（1）温度休克法：包括略低于致死温度的冷休克法(0～5℃)和略高于致死温度的热休克法(30℃左右)两种。

温度休克法廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段。

它受三个因素的制约：温度处理的开始时间,即受精后的时间(TA)处理持续时间(D)处理温度(T)。

（2）水静压法:采用较高的水静压(65 kg／cm。

)来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。

（3）高盐高碱法.3、生物学方法生物学方法主要是通过杂交方法，尤其是种间或不同属、科间的远缘杂交，使染色体加倍，也称为染色体组的合并技术。

如狮子和老虎杂交，马和驴杂交。

多倍体的倍性鉴定:1、直接法：（1）染色体计数法：染色体计数是鉴定多倍性的一个准确的直接方法，但比较费时。

质量好的染色体标本可以从胚胎获得，因为胚胎细胞分裂指数高。

（2）DNA含量测定：流式细胞仪(flow cytomety)可以简单、快速及准确测定单细胞DNA含量，从而确定细胞的倍性。

2、间接法：（1)细胞体积测量：按照一般规律，细胞大小与染色体数目成比例增加，而且为维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。

但多倍体的器官或身体并不一定都比二倍体大。

红细胞体积测量简便易行。

（3）蛋白质电泳（3）生化分析：二倍体和三倍体的血液成分和细胞组成比例不一样。

动物多倍体育种的意义：（1）诱导的多倍体动物多数都具有良好的生长率（2）低等动物(如鱼类等)的种间杂交优势也非常明显。