08.药品微生物限度检测技术

药品微生物限度检查及方法验证从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。

第一部分：外围工作外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。

器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。

培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。

固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。

煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。

万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。

液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。

万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。

消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。

表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。

可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。

另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。

第二部分：检验过程整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。

首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。

进入之前先进行洗手消毒，在一更换鞋，脱去外衣，进入二更，穿洁净工作服，注意穿戴洁净工作衣帽时必须做到衣服的任何部位不得拖地。

微生物限度检测方法微生物限度检测是指在药品、食品、化妆品等产品中，对微生物的数量和种类进行检测，以确保产品的质量安全。

微生物限度检测方法的选择和执行对产品的质量控制和安全性评价具有重要意义。

本文将介绍常见的微生物限度检测方法及其应用。

一、培养法。

培养法是一种常见的微生物限度检测方法，它通过将样品接种在适当的培养基上，利用微生物在培养基上生长、分裂和形成可见的典型菌落的特性，来检测微生物的数量和种类。

培养法主要包括菌落计数法、膜过滤法等。

菌落计数法是将样品均匀涂布在含有营养物质的琼脂平板上，经过一定时间的培养后，根据菌落的数量来确定微生物的数量。

膜过滤法是将样品过滤到孔径为0.45μm的膜上，然后将膜放置在含有营养物质的琼脂平板上培养，根据在膜上形成的菌落数量来确定微生物的数量。

二、生物学法。

生物学法是利用微生物的生物学特性，通过培养微生物或者利用生物学试剂来检测微生物的数量和种类。

生物学法主要包括酶标记法、PCR法等。

酶标记法是利用酶标记的抗体或抗原来检测微生物的数量和种类，其原理是将酶标记的抗体或抗原与待检测微生物发生特异性反应，然后通过酶反应产生显色物质或荧光物质来进行检测。

PCR法是利用聚合酶链式反应技术，通过扩增微生物的特异基因序列来检测微生物的数量和种类。

三、物理化学法。

物理化学法是利用微生物的生理生化特性，通过测定微生物的生长代谢产物或者利用特定的物理化学性质来检测微生物的数量和种类。

物理化学法主要包括ATP生物发光法、流式细胞术等。

ATP生物发光法是利用微生物在生长过程中产生的ATP来进行检测，通过测定样品中的ATP含量来确定微生物的数量。

流式细胞术是利用流式细胞仪对微生物进行快速、高效的检测和鉴定，通过测定微生物在流式细胞仪中的光散射和荧光信号来确定微生物的数量和种类。

综上所述，微生物限度检测方法多种多样，每种方法都有其适用的范围和特点。

在实际应用中，需要根据产品的特点和检测的目的选择合适的检测方法，并严格按照相应的标准和规范进行执行，以确保产品的质量安全。

微生物限度检查法名词解释(一)微生物限度检查法1. 介绍微生物限度检查法（Microbiological Limit Test）是用于评价药品、食品和化妆品等产品中微生物质量的检验方法。

它能够确定样品中是否存在对人体有害的微生物，并对其数量进行定量评估。

2. 相关名词以下是与微生物限度检查法相关的一些常见名词：•微生物限度：指产品中允许存在的微生物或菌群的数量上限。

不同产品类型有不同的微生物限度标准，例如菌落数、霉菌数和大肠菌群数等。

–例如，某药品的微生物限度为每克不超过10个细菌。

•菌落总数：指在特定培养基上，某一样品中培养出的微生物菌落的总数。

–例如，通过菌落总数检验，发现某食品样品中每克菌落总数为100个。

•霉菌数：指在特定培养基上，某一样品中培养出的霉菌菌落的数量。

–例如，某化妆品样品中每克霉菌数为5个。

•大肠菌群数：指在特定培养基上，某一样品中培养出的大肠菌群的数量。

–例如，某食品样品中每克大肠菌群数为0。

3. 检验流程微生物限度检查法的具体流程包括以下几个步骤：1.样品准备：从被检测产品中取样，按照一定的方法进行样品的准备和处理，以便进行后续分析。

2.菌落计数：将样品分别接种在适当的培养基上，并在一定的条件下孵育。

孵育结束后，利用显微镜和计数板等设备，对培养出的微生物菌落进行计数和记录。

3.菌种鉴定：根据菌落的形态、生理特性和生化反应等，对菌落进行鉴定，以确定菌落的种类和数量。

4.结果评价：根据相关的微生物限度标准，将检测结果与标准进行比较，评价样品是否符合质量要求。

5.结果记录：将检测数据和结果进行记录，并生成相应的报告。

4. 应用领域微生物限度检查法广泛应用于以下领域：•药品：验证药品是否符合微生物限度，确保药品的安全和有效性。

•食品：检测食品中是否存在致病菌乃至变质微生物，保障食品的卫生和质量。

•化妆品：评价化妆品中的细菌、霉菌等微生物是否超过限度，确保产品的质量和安全性。

以上就是关于微生物限度检查法的相关名词和解释，以及检验流程和应用领域的简要介绍。

药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。

细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。

特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。

2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。

（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。

（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。

6. 写出验证资料。

示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。

2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。

霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。

2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。

微生物限度的检测原理微生物限度检测原理微生物限度是指在一定数量取样的样品中，允许含有的微生物数量的最大值。

微生物限度检测是一项质量控制的重要措施，可以用于净化水质、食品卫生、医药制品等领域。

检测原理微生物限度检测有两种方法：总生菌数和指示菌。

总生菌数法：常用于食品、医药制品等领域。

该方法将样品进行稀释后，接种到特定的培养基上，经过特定的时间和条件培养，根据生长的菌落数量和菌落特征进行计数和鉴定，计算出每单位重量样品中的菌落总数。

指示菌法：常用于检测细菌和真菌。

该方法是利用一种易于生长、常见、广泛分布但不致病的微生物来代表环境中的各种微生物。

常用的指示菌包括大肠杆菌、肠球菌、铜绿假单胞菌等。

检测步骤1.准备样品：采集样品时要注意采集工具的消毒、避免其他微生物的污染，同时还要考虑样品的保存条件。

2.制备培养基：根据检测方法选择合适的培养基，并按照要求配制好培养基。

3.菌群扩增：将取样和培养基混合，通过摇床、温度控制等方式，使其中的微生物得到充分的生长繁殖。

4.菌落计数：在培养基上形成的单个菌落被认为是由单个微生物生长产生的。

利用计数板或显微镜等设备，对表面菌落数量进行计数。

5.数据处理：根据实验结果计算出微生物限度，并对检测结果进行评估和分析，确定是否符合相应的标准要求。

常见反应溶液1.助溶剂：可使细菌快速释放出细胞内容物。

如：Tween80、Triton X-100等。

2.增殖剂：能够促进细菌的繁殖，加快菌落成长。

如：乳糖、葡萄糖等。

3.抑菌剂：用于防止不需要的菌落生成。

如：抗生素等。

应用领域微生物限度检测广泛应用于食品、饮料、医药制品、环境卫生等领域。

1.食品：微生物限度检测可以帮助食品厂家确定食品的质量和安全性，检测出食品中的致病菌如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。

2.医药制品：微生物限度检测可以检测制药过程中的菌落总数、霉菌数量等指标，确保药品纯度和安全性，避免交叉感染等问题。

3.环境卫生：微生物限度检测可以用于监测空气、水质和表面菌落数量，发现污染源，及时解决环境污染问题。

微生物限度检测方法
微生物限度检测方法是指用于确定特定微生物在某种产品中的存在情况的检测方法。

微生物限度检测方法主要包括菌落计数法、培养方法、生化方法和分子生物学方法等。

1. 菌落计数法：这是一种常用的微生物限度检测方法，主要是通过将样品加入适当的培养基，经过一定的时间后，观察产生的菌落数目来估计微生物的数量。

可以通过直接计数，也可以通过稀释系列来测定数量。

2. 培养方法：培养方法是将样品加入含有适宜营养成分的培养基中，在一定条件下培养微生物，通过观察生长情况、形态特征、生理生化特性等来确定微生物的存在与否。

常用的培养方法有液体培养和固体培养。

3. 生化方法：生化方法是通过检测微生物生长过程中释放的代谢产物来确定微生物的存在与否。

常用的生化方法有气体生成法、乳酸生成法、酶活性测定等。

4. 分子生物学方法：分子生物学方法主要利用特定微生物的DNA或RNA序列进行检测。

常用的分子生物学方法有聚合酶链反应（PCR）、实时荧光PCR、核酸杂交等。

以上是常见的微生物限度检测方法，不同方法的选择取决于具体的检测要求和需求。

药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。

细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。

特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。

2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。

（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。

（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。

6. 写出验证资料。

示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。

2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。

霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。

2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。

版本号：A 修订号：0制药企业微生物限度检验操作规程文件编号：_ABC-RQ-20××__编制：________________审核：________________校订：________________批准：________________发布日期： 20××年1月1日生效日期：20××年1月1日分发部门■总经理■常务副总■财务副总■工程副总■××××部■××××部■××××部■××××部■××××部■××××部■××××部■××××部目录1 微生物计数法 (1)1.1计数方法 (1)1.1.1概念 (1)1.1.2计数方法 (1)1.1.3计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查 (1)1.1.4菌种及菌液的制备 (1)1.1.4.3阴性对照 (3)1.1.4.4培养基适用性检查 (3)1.1.5计数方法适用性检查 (3)1.1.5.1供试品制备 (3)1.1.5.1.1成品、辅料供试液的制备 (3)1.1.5.1.2内包装膜、袋 (4)1.1.5.2接种和稀释 (4)1.1.5.2.1试验组 (4)1.1.5.2.2供试品对照组 (4)1.1.5.2.3菌液对照组 (4)1.1.5.3供试品中微生物的回收 (5)1.1.5.3.1平皿法 (5)1.1.5.3.2薄膜过滤法 (5)1.1.6结果判断 (6)1.2供试品的检查 (6)1.2.1检验量 (6)1.2.2 供试品检查 (6)1.2.2.1阴性对照试验 (7)1.2.2.2平皿法 (7)1.2.2.2.1培养和计数 (7)1.2.2.2.2菌数报告规则 (7)1.2.2.3薄膜过滤法 (8)1.2.2.4培养和计数 (8)1.2.2.5菌数报告规则 (8)1.2.3结果判断 (8)2 控制菌检查法 (9)2.L 简述 (9)2.2培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验 (10)2.2.1菌种 (10)2.2.2菌液制备 (10)2.2.3阴性对照 (11)2.2.4培养基适用性检查 (11)2.2.4.1液体培养基促生长能力检查 (12)I2.2.4.2固体培养基促生长能力检查 (12)2.2.4.3培养基抑制能力检查 (12)2.2.4.4培养基指示特性的检查 (13)2.2.5控制菌检查方法适用性检查 (13)2.2.5.1供试液制备 (13)2.2.5.2试验菌 (13)2.2.5.3适用性检查 (13)2.2.5.4结果判断 (13)2.3供试品检查 (14)2.3.1阳性对照 (14)2.3.2阴性对照 (14)2.3.3大肠埃希菌（Escherichia coli） (14)2.3.3.1供试液制备和增菌培养 (14)2.3.3.2选择和分离培养 (15)2.3.3.3结果判断 (15)2.3.4铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） (15)2.3.4.1供试液制备和增菌培养 (15)2.3.4.2选择和分离培养 (15)2.3.4.3氧化酶试验 (15)2.3.4.4结果判断 (16)2.3.5金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） (16)2.3.5.1供试液制备和增菌培养 (16)2.3.5.2选择和分离培养 (16)2.3.5.3结果判断 (16)附件 (18)附件1：微生物限度检查记录 (18)附件2：计数培养基适用性检查记录 (22)附件3：控制菌检查培养基适用性检查记录 (23)附件4：阳性菌使用记录 (25)II1234567附件附件1：微生物限度检查记录微生物限度检查记录（1/4）微生物限度检查记录（2/4）微生物限度检查记录（3/4）检验人：复核人：微生物限度检查记录（4/4）结论：本品按《中国药典》20××年版二部微生物限度检查法检查，结果。