版药典药品微生物限度检查法

版药典微生物限度检查方法验证方案验证微生物限度检查方法的方案一、实验目的：验证药典中的微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性。

二、实验材料：1.药典中规定的微生物限度检查方法；2.待验证的药品样品；3.适用的培养基和培养条件；4.培养基的质量控制菌种。

三、实验步骤：1.制备适用的培养基：按照药典中规定的方法和成分制备适用的培养基，并进行批次记录。

2.准备质量控制菌种：3.制备菌液悬液：从购买的质量控制菌种中，挑取一株菌种进行连续传代培养至活性最佳的生长阶段。

然后制备菌液悬液，以备后续试验使用。

4.扩大悬液应用范围：从第3步得到的菌液悬液中，取适量接种于适用培养基上，培养出代表性的细菌菌液悬液。

然后，通过菌液的光学检测、显微镜检查和菌落计数，确定菌液的细菌浓度。

5.验证方法的准确性：将待验证的药品样品加入培养基，根据药典中的方法将培养基分成不少于3组。

每组培养基中分别加入一定量的菌液悬液，并在药典规定的温度和时间下培养。

同时，设置对照组，只加入菌液悬液和培养基。

6.菌落计数：取适量的培养基样品，分别进行菌落计数，并根据培养基的数量、培养基总菌落数、对照组的菌落数等数据，计算菌落形成单位。

7.验证方法的可靠性：将待验证的药品样品按照药典中的方法进行连续验证，至少重复3次。

然后，对比不同验证结果的一致性和稳定性，评估方法的可靠性。

8.验证方法的可行性：根据实际的样品情况和验证结果，评估方法在操作上和技术上的可行性。

如，是否存在样品的特殊要求，检测方法是否能满足检测要求等。

四、数据处理与分析：根据实验结果的菌落计数和验证的次数，进行数据处理和统计分析。

评估验证结果的一致性、可靠性和可行性。

五、结论：根据实验结果和数据分析，得出关于药典中微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性的结论。

如果验证结果与药典一致，说明方法可靠并可以使用。

如果验证结果与药典不一致，需要进一步分析原因和进行修正或优化。

我国药典2020微生物限度检查法1.引言我国药典2020版本中，微生物限度检查法是保证药品质量和安全的重要工具。

微生物限度指的是药品中的微生物数量的限定，包括细菌、酵母和霉菌等。

微生物限度检查法的执行对于药品的生产和使用至关重要，它能够保证药品在生产、存储和使用过程中不受到微生物污染，从而确保药品的质量和安全。

2.微生物限度检查法的内容和流程微生物限度检查法主要包括取样、制备试液、接种培养和菌落计数等步骤。

首先要进行取样，从样品中取得代表性的样品；然后是制备试液，将取得的样品溶解或稀释；接下来是接种培养，将制备好的试液接种到适当的培养基上培养；最后是菌落计数，根据培养后的菌落数量来确定微生物的限度。

3.微生物限度检查法的意义微生物限度检查法的实施，可以有效地控制药品中微生物数量的合理范围内，防止药品在生产、储存和使用过程中因微生物污染而导致药品变质、降解或产生毒性。

采用微生物限度检查法，可以杜绝因微生物污染而引起的医源性感染，保障患者用药安全。

4.对我国药典2020微生物限度检查法的个人观点和理解微生物限度检查法是药品质量控制中不可或缺的一部分，它直接关系到患者的用药安全和药品的治疗效果。

我国药典2020版本对微生物限度检查法做了全面更新和完善，包括对检查方法、标准和限度值的详细规定和说明，这对于药品的生产企业和监管部门都具有重要的指导意义。

在日常生产和监管中，执行我国药典2020版的微生物限度检查法，将有助于提高药品的质量和安全水平，保护患者的用药权益，为人民健康事业做出贡献。

5.总结我国药典2020版本中的微生物限度检查法，是药品质量控制中的重要环节。

通过严格执行微生物限度检查法，可以有效地控制药品中微生物数量，防止药品因微生物污染而造成质量问题和安全隐患。

我国药典2020版的微生物限度检查法的更新和完善，将为药品生产和监管提供科学的依据和指导。

在实践中要严格执行微生物限度检查法，确保药品质量和安全，保障患者的用药权益。

版药典非无菌药品微生物限度检查操作规程Revised on July 13, 2021 at 16:25 pm1.目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程;规范检验操作;确保检验结果准确..2.适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试品..3.责任者：QC检验员、QC经理..4.正文：4.1非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法4.1.1简述微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数..当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时;应按下述规定进行检验;包括样品的取样量和结果的判断等..除另有规定外;本法不适用于活菌制剂的检查..本检查法可采用替代的微生物检查法;包括自动检测方法;但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法..微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行..检验全过程必须严格遵守无菌操作;防止再污染;防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出..单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测..如供试品有抗菌活性;应尽可能去除或中和..供试品检查时;若使用了中和剂或灭活剂;应确认其有效性及对微生物无毒性..供试液制备时如果使用了表面活性剂;应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性..4.1.2计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法Most-Probable-NumberMethod;简称MPN法..MPN法用于微生物计数时精确度较差;但对于某些微生物污染量很小的供试品;MPN法可能是更适合的方法..供试品检查时;应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法;所选的方法必须具备检测充足样品量的能力;以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定..所选方法的适用性须经确认..4.1.3计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查..供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验;以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数..若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时;计数方法应重新进行适用性试验..表1试验菌液的制备和使用注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时;应进行培养基适用性检查;检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基..4.1.4菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代;并采用适宜的菌种保藏技术进行保存;以保证试验菌株的生物学特性..计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1..菌液制备按表1规定程序培养各试验菌株..取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物;用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液;将孢子洗脱..然后;采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内;用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液..菌液制备后若在室温下放置;应在2小时内使用；若保存在2～8℃;可在24小时内使用..稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃;在验证过的贮存期内使用..4.1.5阴性对照为确认试验条件是否符合要求;应进行阴性对照试验;阴性对照试验应无菌生长..如阴性对照有菌生长;应进行偏差调查..4.1.6培养基适用性检查微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查..按表1规定;接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板;置表1规定条件下培养..每一试验菌株平行制备2管或2个平皿..同时;用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验..被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内;且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较;试验菌应生长良好..4.1.7计数方法适用性试验⒈供试液制备根据供试品的理化特性与生物学特性;采取适宜的方法制备供试液..供试液制备若需加温时;应均匀加热;且温度不应超过45℃..供试液从制备至加入检验用培养基;不得超过1小时..常用的供试液制备方法如下..如果下列供试液制备方法经确认均不适用;应建立其他适宜的方法..⑴水溶性供试品取供试品;用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液;或pH7.2磷酸盐缓冲液;或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液..若需要;调节供试液pH值至6～8..必要时;用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释..水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液..⑵水不溶性非油脂类供试品取供试品;用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液;或pH7.2磷酸盐缓冲液;或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液..分散力较差的供试品;可在稀释剂中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80;使供试品分散均匀..若需要;调节供试液pH值至6～8..必要时;用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释..⑶油脂类供试品取供试品;加入经过滤除菌的十四烷酸异丙酯使溶解;或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀..表面活性剂的温度一般不超过40℃特殊情况下;最多不超过45℃;小心混合;若需要可在水浴中进行;然后加入预热的稀释剂使成1∶10供试液;保温;混合;并在最短时间内形成乳状液..必要时;用含适宜浓度的无菌聚山梨酯80或其他无抑制性无菌表面活性剂的稀释剂进一步10倍系列稀释..⑷需用特殊方法制备供试液的供试品膜剂供试品取供试品;剪碎;加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液;或pH7.2磷酸盐缓冲液;或胰酪大豆胨液体培养基;浸泡;振摇;制备成1∶10的供试液..若需要;调节供试液pH值至6～8..必要时;用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释..肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品;加入pH6.8无菌磷酸盐缓冲液用于肠溶制剂或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液用于结肠溶制剂;置45℃水浴中;振摇;使溶解;制备成1∶10的供试液..必要时;用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释..气雾剂、喷雾剂供试品取供试品;置冰冻室冷冻约1小时;取出;迅速消毒供试品开启部位;用无菌钢锥在该部位钻一小孔;放至室温;并轻轻转动容器;使抛射剂缓缓全部释出..用无菌注射器从每一容器中吸出全部药液于无菌容器中混合;然后取样检查..贴膏剂供试品取供试品;去掉防粘层;将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上;在粘贴面上覆盖一层适宜的无菌多孔材料如无菌纱布;避免贴膏剂粘贴在一起..将处理后的贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂如聚山梨脂80或卵磷脂稀释液的容器中;振荡至少30分钟..必要时;用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释..⒉接种和稀释按下列要求进行供试液的接种和稀释;制备微生物回收试验用供试液..所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%..为确认供试品中的微生物能被充分检出;首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验..1试验组取上述制备好的供试液;加入试验菌液;混匀;使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu..2供试品对照组取制备好的供试液;以稀释液代替菌液同试验组操作..3菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液;按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验..若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时;应采用适宜的方法对供试液进行进一步的处理..如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除;供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适应性试验..⒊抗菌活性的去除或灭活供试液接种后;按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数..若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的50%;可采用下述方法消除供试品的抑菌活性..⑴增加稀释液或培养基体积..⑵加入适宜的中和剂或灭活剂..中和剂或灭活剂表2可用于消除抗菌剂的抑菌活性;最好在稀释剂或培养基灭菌前加入..若使用中和剂或灭活剂;试验中应设中和剂或灭活剂对照组;即取相应量稀释液替代供试品同试验组操作;以确认其有效性和对微生物无毒性..中和剂或灭活剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.5～2范围内..表2常见干扰物的中和剂或灭活方法⑶采用薄膜过滤法..⑷上述几种方法的联合使用..若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法;对特定试验菌回收的失败;表明供试品对该试验菌具有抗菌活性;同时也表明供试品不可能被该类微生物污染..但是;供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用;而对其他菌株没有抑制作用..因此;根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则;在不影响检验结果判断的前提下;应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行计数方法适用性试验..若方法适用性试验符合要求;应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检查..⒋供试品中微生物的回收表1所列的计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验..微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN法..⑴平皿法平皿法包括倾注法和涂布法..表1中每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿;以算术均值作为计数结果..倾注法取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的中和或消除”制备的供试液1ml;置直径90mm的无菌平皿中;注入15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基;混匀;凝固;倒置培养..若使用直径较大的平皿;培养基的用量应相应增加..按表1规定条件培养、计数..同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数..计算各试验组的平均菌落数..涂布法取15～20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基;注入直径90mm的无菌平皿;凝固;制成平板;采用适宜的方法使培养基表面干燥..若使用直径较大的平皿;培养基用量也应相应增加..每一平皿表面接种上述照“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的中和或消除”制备的供试液不少于0.1ml..按表1规定条件培养、计数..同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数..计算各试验组的平均菌落数..⑵薄膜过滤法薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45μm;直径一般为50mm;若采用其他直径的滤膜;冲洗量应进行相应的调整..选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留..滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌..使用时;应保证滤膜在过滤前后的完整性..水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜..油类供试品;其滤膜和滤器在使用前应充分干燥..为发挥滤膜的最大过滤效率;应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面..供试液经薄膜过滤后;若需要用冲洗液冲洗滤膜;每张滤膜每次冲洗量为100ml..总冲洗量不得超过1000ml;以避免滤膜上的微生物受损伤..取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的中和或消除”制备的供试液适量一般取相当于1g、1ml或10cm2的供试品;若供试品中所含的菌数较多时;供试液可酌情减量;加至适量的稀释液中;混匀;过滤..用适量的冲洗液冲洗滤膜..若测定需氧菌总数;转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数;转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上..按表1规定条件培养、计数..每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜..同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数..⑶MPN法MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法;仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用;本法不适用于霉菌计数..若使用MPN法;按下列步骤进行..取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的中和或消除”制备的供试液至少3个连续稀释级;每一稀释级取3份1ml分别接种至3管装有9～10ml胰酪大豆胨液体培养基中;同法测定菌液对照组菌数..必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂..接种管置30～35℃培养3天;逐日观察各管微生物生长情况..如果由于供试品的原因使得结果难以判断;可将该管培养物转种至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基;在相同条件下培养1～2天;观察是否有微生物生长..根据微生物生长的管数从表3查对被测供试品每1g或每1ml中总需氧菌的最可能数..表3微生物最可能数检索表注：表内所列检验量如改用1g或ml、0.1g或ml和0.01g或ml时;表内数字应相应降低10倍；如改用0.01 g或ml、0.001 g或ml和0.0001 g或ml时;表内数字应相应增加10倍;其余类推..⒌结果判断计数方法适用性试验中;采用薄膜过滤法或平皿法时;试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内；采用MPN法;试验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内..若各试验菌的回收试验均符合要求;照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数..方法适用性确认时;若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求;那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查..4.1.8供试品检查检验量检验量即一次试验所用的供试品量g、ml或cm2..除另有规定外;一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减..检验时;应从2个以上最小包装单位中抽取供试品;大蜜丸还不得少于4丸;膜剂还不得少于4片..一般应随机抽取供试品;取规定容器数;混合;取规定量供试品进行检验..供试品的检查按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定..胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数..阴性对照试验以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验;阴性对照试验应无菌生长..如果阴性对照有菌生长;应进行偏差调查..⒈平皿法平皿法包括倾注法和涂布法..除另有规定外;取规定量供试品;按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定;每稀释级每种培养基至少制备2个平皿..培养和计数除另有规定外;胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30～35℃培养3天;沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5天;观察菌落生长情况;点计平板上生长的所有菌落数;必要时可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告..菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数..点计菌落数后;计算各稀释级供试液的平均菌落数;按菌数报告规则报告菌数..若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15;则两个平皿的菌落数不能相差1倍或以上..菌数报告规则需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级;作为菌数报告取两位有效数字的依据..取最高的平均菌落数;计算1g、1ml或10cm2供试品中所含的微生物数..如各稀释级的平皿均无菌落生长;或仅最低稀释级的平板有菌落生长;但平均菌落数小于1时;以﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数..⒉薄膜过滤法除另有规定外;按计数方法适用性试验确认的方法进行供试液制备..取相当于1g、1ml或10cm2供试品的供试液;若供试品所含的菌数较多时;可取适宜稀释级的供试液;照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中;立即过滤;冲洗;冲洗后取出滤膜;菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养..培养和计数培养条件和计数方法同平皿计数法;每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu..菌数报告规则以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长;以﹤1报告菌数每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品;或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数..⒊MPN法取规定量供试品;按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和供试品接种;所有试验管在30～35℃培养3～5天;如果需要确认是否有微生物生长;按方法适应性试验确定的方法进行..记录每一稀释级微生物生长的管数;从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数的最可能数..4.1.9结果判断需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数包括真菌菌落数；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数包括细菌菌落数..若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求;可使用含抗生素如氯霉素、庆大霉素的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基如玫瑰红钠琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数测定..使用选择性培养基时;应进行培养基适用性检查..若采用MPN法;测定结果为需氧菌总数..各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：101cfu：可接受的最大菌数为20；102cfu：可接受的最大菌数为200；103cfu：可接受的最大菌数为2000：依此类推..若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定;判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定;判供试品不符合规定..稀释液、冲洗液及培养基见非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法通则1106无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法..若供试品符合无菌检查法的规定;仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染..稀释液、冲洗液及培养基见非无菌产品微生物限度检查：控制及检查法..4.2非无菌产品微生物限度检查：控制及检查法4.2.1简述控制菌检查法系用于在规定的试验条件下;检查供试品中是否存在特定的微生物..当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物限度标准时;应按下列规定进行检验;包括样品取样量和结果判断等..本检查法可采用替代的微生物检查法;包括自动检测方法;但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法..供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”通则1105..如果供试品具有抗菌活性;应尽可能去除或中和..供试品检查时;若使用了中和剂或灭活剂;应确认有效性及对微生物无毒性..供试液制备时如果使用了表面活性剂;应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性..4.2.2培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查..供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验;以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查..若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时;控制菌检查方法应重新进行适用性试验..4.2.3菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代;并采用适宜的菌种保藏技术进行保存;以保证试验菌株的生物学特性..金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus〔CMCCB26003〕铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa〔CMCCB10104〕大肠埃希菌Escherichiacoli〔CMCCB44102〕乙型副伤寒沙门菌SalmonellaparatyphiB〔CMCCB50094〕白色念珠菌Candidaalbicans〔CMCCF98001〕生孢梭菌Clostridiumsporogenes〔CMCCB64941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上;30～35℃培养18～24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中;20～25℃培养2～3天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24小时..上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液..菌液制备后若在室温下放置;应在2小时内使用；若保存在2～8℃;可在24小时内使用..生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液;稳定的孢子悬液可保存在2～8℃;在验证过的贮存期内使用..4.2.4阴性对照为确认试验条件是否符合要求;应进行阴性对照试验;阴性对照试验应无菌生长..如阴性对照有菌生长;应进行偏差调查..4.2.5培养基适用性检查控制菌检查用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查..控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查..各培养基的检测项目及所用的菌株见表1..表1控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌见表1于被检培养基和对照培养基中;在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养;与对照培养基管比较;被检培养基管试验菌应生长良好..固体培养基促生长能力检查用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌见表1于被检培养基和对照培养基平板上;在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养;被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致..培养基抑制能力检查接种不少于100cfu的试验菌见表1于被检培养基和对照培养基中;在相应控制菌检查规定的培养温度及不短于规定的最长培养时间下培养;试验菌应不得生长..培养基指示特性检查用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌见表1于被检培养基和对照培养基平板上;在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养;被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致..4.2.6控制菌检查方法适用性试验供试液制备按下列“供试品检查”中的规定制备供试液..试验菌根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株;确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时;采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌..适用性试验按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中；采用薄膜过滤法时;取规定量供试液;过滤;冲洗;试验菌应加在最后一次冲洗液中;过滤后;注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中..依相应的控制菌检查方法;在规定的温度及最短时间下培养;应能检出所加试验菌相应的反应特征..结果判断上述试验若检出试验菌;按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌;应消除供试品的抑菌活性见非无菌产品微生物检查：微生物计数法中的“抗菌活性的去除或灭活”;并重新进行方法适用性试验..。

人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案下表用于记录修订/变更主要内容及历史..目录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法8.偏差与漏项控制9.验证报告会审1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊;产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查..参照中国药典2015版四部附录1105：微生物计数法;以及1106：控制菌检查法的规定;本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证..通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用..人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分;文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性;对霉菌和酵母菌无抑菌活性..甲硝唑在水中微溶;可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响..本验证方案通过试验菌株的回收率测试;首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用;则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查..本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件;按制定的方法进行试验;根据验证结果判断是否符合验证标准..2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性;对其有效性进行评价;保证检验结果的可靠性..本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊;进行微生物限度检查方法的验证..3.组织及职责3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草;由质量部审核;最终由质量负责人批准..验证方案实施完成后;由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告;由质量部审核;最终由质量负责人批准报告..3.2验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后;;由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作;并将该次的培训记录归档..3.3验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差;质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施..3.4 验证工作小组成员表4. 验证进度计划表本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月..5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认5.1.主要检验仪器设备确认表检查人/日期：复核人/日期：5.2.验证所需文件的确认表检查人/日期：复核人/日期：6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认6.1.试验菌种检查表检查人/日期：复核人/日期：6.2试验所需的培养基检查检查人/日期：复核人/日期：6.3.检验样品确认表检查人/日期：复核人/日期：7.验证项目和验证方法7.1试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌..试验菌株的传代次数不得超过5代;并采用适宜的菌种保藏技术进行保存;以保证试验菌株的生物学特性..7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中;30～35℃培养18～24小时;取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/ml的菌悬液备用..接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中;20～25℃培养2～3天;取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/ml的菌悬液备用..接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上;20～25℃培养5～7天;直到获得丰富的孢子..加入3～5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液;将孢子洗脱;吸至无菌试管中;取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/m的孢子悬液备用..菌液制备后若在室温下放置;应在2 小时内使用；若保存在2～8℃;可在24小时内使用..黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃ ;在验证过的贮存期内使用..验证时;对各试验菌的回收率逐一进行验证..7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.3.1.供试液的制备取供试品10g;加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml;振摇;制成1：10的供试液..7.3.2.试验组取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置30～35℃培养箱中培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..另取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置20～25℃培养箱中培养5天;点计菌落数..取1：10的供试液1ml注入平皿中;立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀;平行制备2个平皿..置30～35℃培养箱中培养5天;点计菌落数..另取1：10的供试液1ml注入平皿中;立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀;平行制备2个平皿..置20～25℃培养箱中培养5天;点计菌落数..取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置30～35℃培养箱中培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..另取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置20～25℃培养箱中培养5天;点计菌落数..常规倾注平皿法方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值即试验菌的回收率应在0 .5 2 范围内..常规倾注平皿法方法验证的结果常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验;若各试验菌株的回收率在0.5～2范围内;则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查..如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查;但不适用于需氧菌总数检查;则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查..7.4. 需氧菌总数检查—离心沉淀-薄膜过滤法7.4.1.供试液的制备取供试品10g;加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml;振摇;制成1：10的供试液贮备液..取1:10的供试液贮备液50ml;经500转/分钟离心3分钟;取上清液得供试液..7.4.2.试验组取供试液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次;然后在第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu 的试验菌;过滤..每株试验菌株平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..7.4.3.供试品对照组取供试液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次;平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养5天;点计菌落数..7.4.4.菌液对照组取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml;200ml通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;在余下的100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu的试验菌;过滤..每株试验菌株平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..稀释剂对照组依照7.2项下菌液制备方法;以0.9%无菌氯化钠为稀释液;将各菌液稀释至含菌50～100cfu/ml;然后以500转/分钟离心3分钟;取上层菌液作下面的试验..取上层菌液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次;每株试验菌株平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..7.4.6. 离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值即试验菌的回收率应在0 .5 2 范围内;同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在0 .5 2 范围内..7.4.7.离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：7.4.8. 离心沉淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验;若试验组各试验菌株的回收率在0.5～2范围内;稀释剂对照组各试验菌株的的回收率也在0.5～2范围内;则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的需氧菌总数检查..人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及计数方法进行需氧菌总数计数..7.5.控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法若在7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法的试验中;证实了人工牛黄甲硝唑胶囊有抑菌性;不能使用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查;则为了确保控制菌检查的可靠性;采用可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法进行控制菌检查;按照以下方案进行方法学验证..7.5.1试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准中规定检查的控制菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌;所以选择这两种菌株进行控制菌检查的方法学验证..试验菌株的传代次数不得超过5代;并采用适宜的菌种保藏技术进行保存;以保证试验菌株的生物学特性..7.5.2 控制菌检查方法验证的菌液制备分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中;30～35℃培养18～24小时;取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/ml的菌悬液备用..菌液制备后若在室温下放置;应在2 小时内使用；若保存在2～8℃;可在24小时内使用..验证时;对各试验菌的回收率逐一进行验证..7.5.3大肠埃希菌检查方法验证供试液的制备取供试品10g;加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml;振摇;制成1：10的供试液贮备液..取1:10的供试液贮备液50ml;经500转/分钟离心4分钟;取上清液得供试液..取供试液10ml;加至100 ml0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次;然后在第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入～100cfu的大肠埃希菌;过滤..取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中;42～44℃培养24～48小时..取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～72小时..麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长..组～100cfu/ml;然后以500转/分钟离心3分钟;取上层菌液作下面的试验..取上层菌液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次..取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中;42～44℃培养24～48小时..取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～72小时..麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长..取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..阴性对照应无菌生长..试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：大肠埃希菌检查方法验证结果小结按照验证方案的要求进行试验;若试验组与阳性对照组均检出典型大肠埃希菌;阴性对照组无菌生长;则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的大肠埃希菌检查..人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及大肠埃希菌检查方法进行检查..菌检查方法验证7.5.4.1供试液的制备取样品10g加0.9%无菌氯化钠溶液至100 ml制成1:10的供试液..取全部供试液经500转/分钟离心4分钟;取全部上清液为供试液..7.5.4.2.试验组取全部供试液;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次..然后在第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入～100cfu的乙型副伤寒沙门菌;过滤..取膜接种至200ml 胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基;30～35℃培养18～24小时..取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～48小时..沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好;菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色..用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落;于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种;培养18～24小时.. 7.5.4.3阳性对照组～100cfu/ml;然后以500转/分钟离心3分钟;取上层菌液作下面的试验..取上层菌液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次..取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基;30～35℃培养18～24小时..取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～48小时..沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好;菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色..用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落;于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种;培养18～24小时..7.5.4.4阴性对照组取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..阴性对照应无菌生长..7.5.4.5离心沉淀-薄膜过滤法测定乙型副伤寒沙门菌方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：7.5.4.6乙型副伤寒沙门菌检查方法验证结果小结按照验证方案的要求进行试验;若试验组与阳性对照组均检出典型乙型副伤寒沙门菌;阴性对照组无菌生长;则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的乙型副伤寒沙门菌检查..人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及乙型副伤寒沙门菌检查方法进行检查..8.偏差与漏项控制：微生物限度检查方法验证过程中存在和发现的任何偏差与漏项;都应进行详细的记录;并应按公司GMP文件偏差处理规程进行调查与处理..偏差调查与处理的报告和支持文件;应作为此确认方案的附录部分..检查人/日期：复核人/日期：9.验证报告会审验证报告会审表。

中华人民共和国药典2000版二部微生物限度检查法附录Ⅺ J 微生物限度检查法微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法,包括染菌量及控制菌的检查。

供试品应随机抽样。

一般抽样量为检验用量(2个以上最小包装单位)的3倍量。

检查的全过程,均应严格遵守无菌操作,严防再污染。

除另有规定外,本检查法中细菌培养温度为30~35℃,霉菌、酵母菌培养温度为25 ~28℃,控制菌培养温度为36℃±1℃。

检验结果的报告以1g、1ml或10cm<2>为单位。

培养基及其制备方法除另有规定外,培养基制备的灭菌条件为121℃20分钟。

1.营养琼脂培养基与营养肉汤培养基见无菌检查法(附录Ⅺ H)2.玫瑰红钠琼脂培养基胨 5g 玫瑰红钠 0.0133g葡萄糖 10g 琼脂 15~20g磷酸二氢钾 1g 水 1000ml硫酸镁 0.5g除葡萄糖、玫瑰红钠外,取上述成分,混合,加热溶化后,滤过,加入葡萄糖、玫瑰红钠,分装,灭菌。

3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)胨 10g 琼脂 15~20g酵母浸出粉 5g 水 1000ml葡萄糖 20g除葡萄糖外,取上述成分,混合,加热溶化后,滤过,加入葡萄糖,分装,灭菌。

4.胆盐乳糖培养基(BL)胨 20g 磷酸二氢钾 1.3g乳糖 5g 牛胆盐 1.3g氯化钠 5g (或去氧胆酸钠0.5g)磷酸氢二钾 4.0g 水 1000ml除乳糖、牛胆盐外,取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2, 煮沸,滤清,加入乳糖、牛胆盐,分装,灭菌。

5.曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)营养琼脂培养基 100ml 曙红钠指示液 2ml20%乳糖溶液5ml 亚甲蓝指示液 1.3~1.6ml 取营养琼脂培养基,加热溶化后,冷至60℃,按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液, 摇匀,倾注平皿。

6.麦康凯琼脂培养基(MacC)胨 20g 1%中性红指示液 3ml乳糖 10g 琼脂 15~20g牛胆盐 5g 水 1000ml氯化钠 5g除乳糖、指示液、牛胆盐及琼脂外,取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。

中国药典微生物限度检查法
中国药典是中华人民共和国国家药品监督管理局编制的用于药品质量标准和规范的权威性文献。

其中，微生物限度检查是对药物产品中的微生物污染进行评估和控制的重要环节。

中国药典中的微生物限度检查法主要包括以下几个方面：
1.检测项目：微生物限度检查主要关注细菌、真菌和酵母菌
的存在与数量。

通常会检测大肠杆菌、铜绿假单胞菌、霉
菌和酵母菌等常见微生物。

2.样品准备：样品准备过程中，要根据具体要求制备适当稀
释的样品溶液。

根据不同产品的特点和要求，可能需要使
用适当的培养基进行预处理。

3.检测方法：中国药典中提供了一系列的微生物限度检测方
法，包括涂片法、水洗法、滤膜法等。

这些方法可以根据
不同的样品类型和特性选择适合的检测方法。

4.培养和观察：按照检测方法的要求，将样品接种在适当的
培养基上，进行培养并观察一定时间。

观察期间，需要注
意各种细菌、真菌和酵母菌的生长情况。

5.计数和判定：根据培养结果，进行微生物数量的计数，并
与规定的限度标准进行比较。

根据比较结果，判定样品是
否符合微生物限度标准。

通过微生物限度检查，可以评估药物产品中的微生物污染状况，并确保其在接受者使用时的安全性。

中国药典中的微生物限度
检查法为药品质量控制提供了重要的指导和标准。

中国药典微生物限度检查法- 概述《中国药典》2010版一部、二部、三部附录的微生物限度检查法内容无差别，故此文方法，以《中国药典》2010版二部附录ⅪJ为例。

微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。

除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。

检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。

注：《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准分为GB/T16292-2010 医药工业洁净室(区)悬浮粒子的测试方法GB/T16293-2010 医药工业洁净室(区)浮游菌的测试方法GB/T16294-2010 医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法中国药典微生物限度检查法- 检验量和供试液制备检验量检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm²）。

除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm²；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。

要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。

检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。

一般应随机抽取不少于检验用星（两个以上最小包装单位）的3倍最供试品。

供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。

供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。

中国药典2020微生物限度检查（原创版）目录1.2020 版《中国药典》微生物限度检查概述2.非无菌产品微生物限度的检查要点3.微生物限度计数及其在药典中的应用4.药典委发布的相关国家标准草案5.中药饮片微生物限度检查法6.美国药典 USP 微生物限度检查概述正文2020 版《中国药典》微生物限度检查概述2020 版《中国药典》是药品质量标准的重要参考文献，其中包含了关于微生物限度检查的详细规定。

微生物限度检查旨在确保药物的微生物质量符合标准，从而保证患者的安全和药物的有效性。

在药典中，微生物限度检查涉及到非无菌产品、生物制品以及中药饮片等多个领域。

非无菌产品微生物限度的检查要点非无菌产品的微生物限度检查是药典中的一个重要内容。

这类产品在使用过程中，需要确保其微生物数量不超过一定的限度，以避免微生物污染对患者造成不良影响。

检查要点包括：菌种及菌液制备、培养基的选择、培养条件、计数方法等。

微生物限度计数及其在药典中的应用微生物限度计数是药典中关于微生物数量限制的一个重要指标。

在药典中，微生物限度计数主要有两种方法：一种是基于菌落形成的计数方法，另一种是基于荧光定量 PCR 法的计数方法。

这些方法在药典中得到了广泛应用，为药物的微生物质量控制提供了重要依据。

药典委发布的相关国家标准草案为了不断完善和提高药物质量标准，药典委发布了一系列相关的国家标准草案。

这些草案包括《微生物限度检查法》、《生物制品》等。

这些标准的发布和实施，将有助于进一步提高药物的微生物质量，保证患者的用药安全。

中药饮片微生物限度检查法中药饮片微生物限度检查法用于检查中药材及中药饮片的微生物污染程度。

检查项目包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、耐热菌总数、耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌等。

中药饮片微生物限度检查的试验环境应符合微生物限度检查的要求，全过程必须严格遵守无菌操作。

美国药典 USP 微生物限度检查概述美国药典（USP）也是药品质量标准的一个重要参考文献。

微生物限度中国药典2020年版四部通则1105、1106、
1107
摘要：
一、微生物限度检查的重要性
二、中国药典2020 年版四部通则1105、1106、1107 介绍
三、微生物限度检查方法
四、微生物限度检查在药品质量管理中的作用
正文：
微生物限度检查在药品生产和质量控制中扮演着至关重要的角色。

它旨在确保药品中微生物的数量和种类符合规定标准，以避免微生物污染和药品失效。

在中国，药品的微生物限度检查主要依据《中国药典》进行。

《中国药典》2020 年版四部通则1105、1106、1107 对微生物限度检查进行了详细规定。

其中，1105 通则规定了非无菌药品微生物限度检查的基本要求和方法；1106 通则针对无菌药品的微生物限度检查进行了规定；1107 通则则对微生物限度检查中使用的培养基、试剂和仪器等进行了详细说明。

微生物限度检查方法主要包括计数法和定性法。

计数法是通过计算样品中微生物的数量来判断其是否符合规定标准；定性法则是通过观察和鉴定微生物的种类，以确定其是否为有害微生物。

这两种方法在实际应用中往往相互结合，以提高检查的准确性。

微生物限度检查在药品质量管理中发挥着重要作用。

首先，它为药品生产过程中的微生物控制提供了依据，帮助企业制定合理的生产工艺和质量控制策
略。

其次，微生物限度检查可以有效防止药品在生产和储存过程中的微生物污染，保证药品的安全性和有效性。

最后，微生物限度检查还有助于药品监管部门对药品质量进行监督和评价，确保药品市场秩序和公众用药安全。

总之，微生物限度检查在药品质量管理中具有重要意义。

版药典非无菌药品微生物限度检查操作规程一、目的和适用范围本操作规程适用于版药典非无菌药品微生物限度检查，旨在确保非无菌药品的微生物限度符合药品质量标准的要求。

二、仪器和试剂1.微生物检测平台2.高效液相色谱仪3.恒温培养箱4.秤5.紫外可见分光光度计6.无菌培养基及培养皿7.灭菌蒸馏水三、操作步骤1.样品采集a.按规定从批号符合要求的药品包装中采集样品。

b.采样前，确保采样容器和工具进行充分清洗和灭菌处理。

c.将样品转移至无菌容器中，避免样品污染。

2.样品制备a.取适量样品称重，以满足检测要求。

b.若样品含有可溶性成分，加入足量适宜溶解剂使样品溶解。

c.若样品含有微生物抑制剂，加入足量无菌培养基或适宜抑菌剂。

3.微生物限度检查a.样品制备后，根据药典要求，采用鹅颈漏斗法、转接法等方法接种。

b.加入适宜培养基，保证培养基覆盖样品。

c.培养后，将培养皿置于恒温培养箱进行培养，并控制培养温度和时间。

d.培养结束后，根据药典要求，观察培养皿上是否有微生物生长。

e.若有微生物生长，根据不同菌种，进行计数或定性鉴定。

4.检测结果记录a.对于微生物限度检查合格的样品，记录样品编号、检测日期、检测人员和结果。

b.对于微生物限度检查不合格的样品，记录样品编号、检测日期、检测人员、结果以及不合格原因，并进行进一步分析和处理。

5.数据分析和处理a.对不合格的样品，进行排查原因分析，避免数据误差。

b.若样品不合格原因无法排查，可进行复检或采取其他措施，以消除样品中的微生物污染。

四、操作注意事项1.操作过程中，保持操作台面整洁，避免外部微生物污染。

2.检测前，检查仪器设备是否正常工作。

3.检测过程中，注意操作规范，避免人为污染。

4.样品制备过程中，注意避免样品污染和交叉感染。

5.检测结果要准确记录和保存，以备日后使用。

五、附件本操作规程必须配备以下附件：1.样品采集记录表2.样品制备记录表3.微生物限度检查结果记录表六、术语定义1.微生物限度：指药品中微生物的上限或下限，即在质量标准要求下，药品中可以存在的微生物数量范围。

2024年版《中国药典》附录对无菌检查和微生物限度检查方法进行了修订和增加。

以下是关于这一主题的详细内容：
无菌检查方法增修定内容：
1.增加了无菌药剂的质量标准，包括药品无菌指标、瓶口、塞口、包装的无菌性检查项等。

2.添加了无菌药物瓶内环境的无菌性检查，包括对封口口径、管壶内外的无菌环境进行验证等。

3.对无菌药剂进行质量控制的方法进行了详细说明，包括无菌药剂质量控制中的负压系统及其验证、不同类型的无菌药剂的质量控制措施等。

4.新增了一些无菌技术和设备的要求，如微生物孵育器使用要求、灭菌器使用要求等，以保证无菌检查的准确性和可靠性。

5.对于不同类型的无菌药剂，如注射剂、眼用药、口服药剂等，增加了不同的无菌检查方法，以确保药品的无菌性。

微生物限度检查方法增修定内容：
1.添加了微生物限度试验中的菌落计数法、薄膜法、糖蜜膏孵化法等方法详细操作步骤和评价标准。

2.对于微生物限度试验中的微生物生长培养基、培养条件等进行了规定，确保在适当的环境中进行试验。

3.说明了微生物限度试验中的不同尺寸、不同生物指标等的不同试验方法，以适应不同药物的检验需求。

4.对于微生物限度试验中存在的一些可能出现的问题和异常结果进行了评价和处理措施的说明，以保证试验结果的准确性和可靠性。

5.增加了微生物限度试验的资料归档和报告的要求，确保试验结果的准确可靠性和追溯性。

通过对无菌检查和微生物限度检查方法进行修订和增加，2024年版《中国药典》附录进一步提高了无菌药剂和微生物限度的质量控制水平，确保了药品的安全和有效性。

这些修订和增加内容使无菌检查和微生物限度检查方法更加完善和规范化，为药品生产和质量控制提供了更科学、更可靠的依据。