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猪骨髓间充质干细胞的培养与分离实验准备：器材：手术刀片，手术刀柄，剪刀，镊子，弯钳，5ml灭菌注射器，7号注射针头，10ml离心管，离心机，100mm培养皿，75ml培养瓶试剂：低糖DMEM（含有10%FBS,75μg/ml青霉素，50μg/ml硫酸链霉素）1000iu/ml青链霉素的PBS（生理盐水）(装入灭菌的洗瓶中)无血清低糖DMEM.2%台盼蓝染液材料采集：一，胎猪骨髓采集：【1】 1，无菌条件下从猪子宫内取出胎儿置入到保温瓶中，加入含有青链霉素的PBS或生理盐水中，立即送回实验室。
2，在无菌操作下取下左右股骨，除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS冲洗3-4次用灭菌生理盐水冲洗干净，在超净工作台内剥离肌肉和骨膜，得到完整的股骨。
立即用含有1.0ml DMEM+3000iu/ml肝素的注射器冲骨髓腔，迅速换上5号的针头将冲出的骨髓血轻轻吹打，再加入等量培养液（DMEM+10%FBS）稀释，然后以1:4比例缓慢加入到Percoll分离液（1.073g/ml）的表面，1000r/min 30min,小心吸取乳白色的有核细胞层。
目前用于分离MSCs的方法主要有密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和贴壁筛选法。
密度梯度离心法目前主要包括利用percoll分离液分离MSCs和利用淋巴细胞分离液分离MSCs两种。
Percoll密度梯度离心法根据细胞密度不同将细胞分为数层，因此得到的MSCs纯度较高，但是操作繁琐，而淋巴细胞密度梯度离心法虽得到的MSCs不及percoll密度梯度离心法得到的细胞纯度高，但是操作简单，且获得的MSCs增殖活性较强。
【13】来自:胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离取2-3月龄猪胎儿，在无菌操作下取下左右股骨，用含1000iu/ml青链霉素的PBS浸泡30min,除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS冲洗3-4遍；用吸有4ml а-MEM细胞培养液的一次性无菌5ml注射器刺入处理好的股骨的一端，冲出骨髓，然后用7号针头轻轻吹吸数次，使冲出的骨髓尽可能分散为单个细胞，100目滤沙过滤；1000rpm/min,离心5min,用а-MEM细胞培养液制成细胞悬液，计数后，调整有核细胞的密度为1-2x107/ml.,然后接种培养。
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法一、分离方法说明及图例A.Ⅰ.取新鲜抗凝血液或脐带血与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；Ⅱ.取新鲜抗凝骨髓，加入一份细胞洗涤液（Cat#：2010X1118），混匀后以400g（约1500转/分）离心5分钟，弃去上清。
沉淀与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；B.加入为步骤A中所得混合液1/2体积的全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀20℃-30℃自然沉降20-30分钟，吸取上清备用；C.向步骤B中所得上清液中加入为其一倍以上体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）混匀，以500g（约1800转/分）离心15分钟（半径15cm水平转子），弃去上清保留沉淀细胞；D.向细胞沉淀中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）调整细胞浓度为2×108—1×109个/ml，小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2:1）；（本实验采用天津灏洋TBD生物实验室的分离液）E.以400g（约1500转/分）离心20分钟（半径15cm水平转子）；第三层；为透明分离液层。
第四层；为极少数红细胞层。
收集第二层细胞放入约为其5-10倍体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）中，充分混匀后以500g（约1800转/分）离心1 5分钟。
沉淀经反复洗涤2次既得所需干细胞。
F.为获得纯度更高的干细胞，在步骤E中离心完成后可吸取第二层干细胞层再与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混匀，20℃-30℃自然沉降20-30分钟，收集上清加入细胞洗涤液500g（约1800转/分）离心15分钟。
大鼠骨髓淋巴细胞分离液使用方法
大鼠骨髓淋巴细胞分离液的使用方法如下：
1. 悬浮细胞：将需要进行分离的细胞悬浮在分离液中。
2. 离心：将悬浮液在2000rpm的转速下离心5分钟，收集沉淀的细胞。
3. 清洗：使用清洗液清洗离心后的细胞沉淀，以去除杂质和多余的分离液。
4. 再次离心：将清洗后的细胞在相同条件下再次离心，以进一步纯化细胞。
5. 培养：将纯化后的细胞接种到培养基中进行培养，以进行后续的实验或研究。
需要注意的是，大鼠骨髓淋巴细胞分离液需要在无菌条件下操作，且启封后应置常温保存。
如果需要在4℃保存，应避免出现白色结晶，以免影响分离效果。
此外，该试剂盒易感染细菌，因此在使用过程中需要特别注意无菌操作。
以上是大鼠骨髓淋巴细胞分离液的使用方法，仅供参考，如需获取更多详细信息，建议查阅相关网站。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。
用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。
用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。
在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。
本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。
BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。
因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。
近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。
BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。
细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。
其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。
本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。
具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。
细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。
细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。
细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。
通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。
通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。
经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。
在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。
这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3[导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 )( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 )( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 )【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。
结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。
传至10代仍具有良好的增殖活性。
流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。
结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。
BMSCs的分离培养、纯化与鉴定作者：马民吕志刚杜以宽张桂娟马义【摘要】目的建立一种持续、稳定的可多向分化的骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养体系。
方法运用密度梯度离心法从1月龄新西兰兔骨髓中分离培养BMSCs，利用相差显微镜观察其形态及生长情况，扫描电镜观察其细胞结构，运用流式细胞术分析分离细胞群所处细胞周期和细胞活力，用MTT比色法绘制细胞生长曲线，并用特定诱导液将分离的BMSCs向成骨细胞和成脂肪细胞定向诱导分化，利用ALP和油红O进行染色鉴定。
结果所分离的BMSCs细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs特征，分离培养的BMSCs细胞在第3天进入对数生长期，第10天进入平台期；在成骨、成脂肪的诱导培养条件下，分别出现成骨、成脂肪表型特征，可进一步定向分化，结论所收获的细胞具有BMSCs的特异性。
【关键词】骨髓间充质干细胞；分离；成骨分化；成脂分化【Abstract】 Objective To establish a sustained and stable bone marrow derived mesenchymal stem cells (BMSCs) isolation and culture system which could be pluripotential in vitro. Methods BMSCs were isolated and cultured from the 1month old New Zealand white rabbits through density gradientcentrifugation. Growth and ultromicrostructure of the BMSCs were observed by light microscope and scan electron microscope. The cell activities and cell cycle were observed by flow cytometry. The grow curve of the BMSCs was described through MTT assay. BMSCs were induced and differentiate into osteoblasts and adipocytes by specific induction culture medium. Then the cells were stained with alkaline phosphatase (ALP) and Oil red O , and analyzed the result of all staining. Results The isolated BMSCs cells were in line with the characteristics of BMSCs in morphology and growth kinetics, and the isolated BMSCs cells would be into the logarithmic growth phase in the third day and into the platform phase in the tenth day. Conclusions In the osteogenic and adipogenic induced culture conditions, BMSCs have appeared the phenotypic characteristics of osteogenic and adipogenic respectively, and could be further directed differentiation. These indicated the harvested cells possessed BMSCs specificity.【Key words】 Bone marrow derived mesenchymal stem cells(BMSCs); Isolation; Osteogenic differentiation; Adipogenic differentiation软骨组织工程技术〔自体软骨细胞的移植、生长因子对软骨细胞的作用、骨髓间充质干细胞（又称骨髓基质干细胞，BMSCs）在软骨组织工程中的作用、转基因技术〕是当今的研究热点〔1，2〕。
大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性曹华;高建华;刘小龙;林思思【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2017(021)009【摘要】背景：如何能简便高效地获得均质性的骨髓间充质干细胞群是软骨组织工程研究的重点。
目的：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,观察其生物学特性。
方法：抽取30只SD大鼠股骨以及胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁培养法体外分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪测定细胞表面标记物的表达,细胞计数法观察细胞生长增殖能力,MTT法检测细胞存活率。
结果与结论：（1）刚分离培养的细胞呈圆形、椭圆形,部分细胞呈三角形,接种12-15 d后,细胞开始融合,传代后细胞增殖速度加快,传代2 h后细胞均匀分布在瓶底;（2）随着传代次数的增加,细胞增殖能力出现下降趋势,第1-5代细胞存活率均超过95%,显著高于第6代和第7代（P〈0.05）;（3）骨髓间充质干细胞表面CD34呈阴性表达,CD44呈阳性表达;（4）结果表明,采用全骨髓贴壁法可有效分离大鼠骨髓间充质干细胞,获得的细胞生长稳定,增殖能力强,可选用前5代细胞作为软骨组织工程的种子细胞。
【总页数】5页(P1357-1361)【作者】曹华;高建华;刘小龙;林思思【作者单位】[1]江西医学高等专科学校,江西省上饶市334000;[2]南昌大学医学部,江西省南昌市330006【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.骨髓间充质干细胞分离鉴定及在糖尿病大鼠肾脏保护中的机制研究 [J], 康岩;李志杰;王丽娜;郭玉卿;刘璠;张洁2.大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定及免疫调节性能初探 [J], 张志强;刘义;李克秋;李光3.大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性 [J], 曹华;高建华;刘小龙;林思思4.大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定及其在胶质瘤治疗中的作用 [J], 刘辉;张鹏幸;范菲艳;刘楠;任东妮;张永生;涂艳阳5.不同分离及培养方法对大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖和生物学特性的影响 [J], 贾贵清;张明鸣;杨平;程惊秋;陆燕蓉;伍晓汀因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
动物骨髓干细胞细胞分离液试验方法
货号：P8600
规格：200mL
保存：常温保存，有效期2年。
本品易感染细菌，需无菌条件操作。
无菌条件下操作，启
封后置常温保存。
如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
产品内容：
名称规格
动物骨髓干细胞分离液200mL
匀浆冲洗液200mL
样本稀释液200mL
清洗液200mL
洗涤液200mL
无菌硅化离心管5支
实验前准备：
1、适用仪器
最大离心力可达1200g的水平转子离心机
骨髓单细胞悬液的制备：
1.以适当方式处死动物，剥离出股骨或胫骨，用剪刀剪断骨头两端，露出内腔。
2.用注射器吸取适量（根据动物大小）的匀浆冲洗液冲洗出内腔中的骨髓。
3.收集悬液到合适离心管中，反复吹打成单细胞悬液，以70μm细胞筛网（随试剂盒附赠5个）过滤。
4.450g，离心10min，弃上清。
5.用样本稀释液重悬细胞浓度为2×108-1×109/ml的单细胞悬液备用（以小鼠为例，一般使用1ml样本稀释液重悬骨髓细胞）。
检验方法：
全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
1.取一支离心管，加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于3ml）。
2.用吸管小心吸取骨髓单细胞悬液加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min。
（注：根据骨髓单细胞悬液量确定离心条件，骨髓单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
3.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。
第一层为稀释液层。
第二层为环状乳白色目的细胞层。
第三层为透明分离液层。
第四层为红细胞层。
4.用吸管小心吸取第二层环状乳白色目的细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入5-10ml洗涤液，混匀细胞。
5.400g，离心10min。
6.弃上清。
7.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。
8.250g，离心10min。
9.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。
差异贴壁法纯化细胞：
（1）用干细胞无血清培养基或干细胞完全培养基以1.5-3×106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。
（2）2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。
（3）10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。
（4）不贴壁的为淋巴细胞。
注：a)无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加10%自体血浆或2-8%胎牛血清。
b)完全培养基中含2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。
c)由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成本相对较低。
如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴性分选。
注意事项：
1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
为获得最佳的实验结果，最好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。
样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
2.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。
3.吸取过多的目的细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。
4.分离液用量大于骨髓单细胞悬液样本量时，分离效果更佳。
可能存在的问题及解决方法：
1.由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：
出现情况出现原因建议解决方案离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层转速过小或离心时间过短适当增减转速离心后目的细胞存在于分离液中转速过大或离心时间过长
离心后白环层弥散细胞密度过大调整细胞密度离心后白环层太浅或看不见细胞密度过小
2.本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。
不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。
建议对离心条件进行调整时，恒定离心时间，对离心转速进行调整。
3.本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。
注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以50-100g为基数，直至达到最佳分离效果，离心力最小不得小于400g，最大不得大于1200g。
离心时间以20-30min为准。
