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动脉粥样硬化（LDLR）小鼠模型介绍
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种复杂的慢性炎症疾病，包括冠状动脉疾病、心肌梗死、多种亚型脑卒中、外周血管疾病和主动脉瘤，主要特征是动脉壁上斑块积聚。
基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型是目前较为认可的探讨动脉粥样硬化发病机制及寻找新药物靶点的关键工具，也应用于潜在抗动脉粥样硬化药物的药理和毒理研究。
载脂蛋白E(ApoE)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和B类Ⅰ型清道夫受体(SR-B1)等基因的表达促进机体脂质、胆固醇和低密度脂蛋白等转运和代谢，维持血管正常功能，敲除这些基因会引起脂质转运及代谢紊乱从而诱发动脉粥样硬化及并发症的发生发展。
LDLR是介导胆固醇进入细胞的主要受体，ApoB 100作为 LDL主要的载脂蛋白，在高脂肪饲料喂养的动物中与富含甘油三酯的VLDL浓度呈正相关。
LDLR被敲除或沉默影响胆固醇的转运，破坏细胞内胆固醇平衡，造成胆固醇聚积在动脉壁，诱发AS。
LDLR基因敲除(LDLR -/-)小鼠AS模型具有在人类家族性高胆固醇血症中观察到主动脉瓣和主动脉根部的病变特征，是目前在AS研究领域中应用最多的基因工程动物模型之一。
LDLR基因突变也是当前研究的一个热点，目前至少已发现180种LDLR基因突变型，一些研究通过构建LDLR基因突变小鼠来研究基因突变导致的动脉粥样硬化发病机制。
动脉粥样硬化造模方法1.引言1.1 概述概述动脉粥样硬化是一种常见的血管疾病，其主要特征是动脉壁内聚积了大量脂质沉积物，导致动脉管腔狭窄甚至闭塞，严重威胁人类健康。
为了深入研究动脉粥样硬化的发病机制，科学家们发展了许多造模方法，用于模拟和研究该疾病的发生与发展过程。
动脉粥样硬化的造模方法包括动物模型和体外模型两种。
动物模型是通过将动物暴露在特定环境或进行特定操作来诱发动脉粥样硬化，从而使动物模型具有与人类疾病相似的特点。
常用的动物模型包括小鼠、兔和猪等。
这些动物模型在解剖结构、生理功能和代谢方式等方面与人类相对接近，能够为研究提供重要参考。
另一方面，体外模型是通过将动脉粥样硬化的发生与发展过程在实验室中进行模拟，以研究其相关机制。
体外模型包括细胞培养模型和体外血管模型。
其中，细胞培养模型利用培养的细胞，如内皮细胞和平滑肌细胞等，进行各种实验和研究。
体外血管模型则是通过构建人工动脉血管或使用已移植的动脉片段，在实验室中模拟动脉粥样硬化的病理改变，以评估新药物或治疗方法的疗效。
综上所述，动脉粥样硬化的造模方法为研究这一疾病的发病机制和寻找治疗方法提供了重要手段。
通过动物模型和体外模型的研究，科学家们可以更好地理解动脉粥样硬化的发展过程，进一步推动该疾病的防治工作。
随着技术的不断进步，相信在不久的将来，动脉粥样硬化的造模方法将会得到进一步的发展和应用。
1.2 文章结构文章结构是指文章的组织框架和布局方式，它对于文章的整体逻辑和内容的呈现非常重要。
本文将分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分将提供一些背景信息和引出主题。
在概述中，将简要介绍动脉粥样硬化的基本概念和病因，引起读者对这一疾病的兴趣。
接着，在文章结构的第二小节中，将详细描述本文的结构和内容安排，以帮助读者更好地理解文章的整体布局。
最后，明确本文的目的，即什么是动脉粥样硬化造模方法，为什么研究这个方法的重要性。
正文部分将对动脉粥样硬化造模方法进行详细讨论。
急性冠脉综合征患者血小板表面CD40L及血清sCD40L变化研究发表时间：2011-02-14T13:29:53.373Z 来源：《中外健康文摘》2010年第35期供稿作者：张丹1 王姝丽2 [导读] 同时除外冠心病以外的其它心脏疾病、心衰、二尖瓣关闭不全、旁路移植术后及3个月内行溶栓治疗者。
张丹1 王姝丽2（1长春市中心医院心血管内科 130051;2 山东省立医院保健老年心血管科 250021）【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)35-0027-03【摘要】目的探讨血小板表面CD40L和血清可溶性CD40L（sCD40L）与急性冠脉综合征（ACS）的关系。
方法选取ACS患者32例（心肌梗死14例、不稳定心绞痛18例），稳定性心绞痛患者13例，同时选取10例健康成人作对照。
分别应用流式细胞术和ELISA法测定血小板表面CD40L及血清sCD40L水平。
随访ACS患者1月，测定其血清sCD40L水平。
结果 FCM测定结果显示，AMI组和UA组血小板表面CD40L 表达水平明显高于SA组及对照组（P<0.05），UA组CD40L水平显著高于AMI组（P<0.05），SA组与对照组比较无显著差别；ELISA测定血清sCD40L结果显示，AMI组和UA组血清sCD40L表达水平明显高于SA组及对照组（P<0.05）。
AMI组sCD40L水平显著高于UA组（P<0.05），SA与对照组比较无显著差别。
结论急性冠脉综合征患者血小板表面CD40L表达增加，血清sCD40L水平升高，因此CD40L可能成为预测斑块稳定状态的一个指标。
【关键词】 CD40L CD40 急性冠脉综合征急性冠脉综合征（acute coronary syndrome, ACS）约占冠心病总数的30%，是引起冠心病病人死亡的主要原因。
CD40L属于肿瘤坏死因子超家族（TNF），主要表达于活化的CD4+T淋巴细胞、部分活化的CD8+T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞，NK细胞也有表达。
（一）动脉粥样硬化模型常选用兔、猪、大鼠、鸡、鸽、猴和犬等动物。
常用的复制方法有下面几种（包括高血脂模型）：1．高胆固醇、高脂肪饲料喂养法：是目前比较常用的方法，特点是死亡率低，可长期观察，但费时久。
一般在家兔、鸽、鸡等，经数周喂养就可产生明显的高脂血症，经数月就能形成早期的动脉粥样硬化病变。
大白鼠、小白鼠及犬则较难形成，如果饲料中增加蛋黄、胆酸和猪油等，可用促进作用。
为了促进病变的形成，在高脂饲料中还可加入甲基硫氧嘧啶、丙基硫氧嘧啶、甲亢平、苯丙胺、维生素D、烟碱或蔗糖等。
具体复制方法：兔诱发模型：体重2kg左右，每天喂服胆固醇0.3g，4个月后肉眼可见主动脉粥样硬化斑块；若每天剂量增至0.5g，3个月后可出现斑块；若增至每天1g，可缩为2个月。
在饲料中加入15%蛋黄粉、0.5%胆固醇和5%猪油，经3周后，将饲料中胆固醇减去，再喂3周，可使主动脉斑块发生率达100%，血清胆固醇可长高至2000mg%。
大白鼠诱发模型：喂服1～4%胆固醇、10%猪油、0.2%甲基硫氧嘧啶、86～89%基础饲料，7～10天；或喂服10%蛋白黄粉、5%猪油、0.5%胆盐、85%基础饲料，7天后均可形成高胆固醇血症。
小白鼠诱发模型：雄性小白鼠饲以1%胆固醇及10%猪油的高脂饲料，7天后血清胆固醇即升为343±15mg；若在饲料中再加入0.3%的胆酸，连饲7天，血清胆固醇可高达530±36mg%。
鸡、鸽诱发模型：4～8周的莱克享鸡，在饲料中加入1～2%胆固醇或15%的蛋黄粉，再加5～10%的猪油，经过6～10周，血胆固醇升至1000～4000mg%，胸主动脉斑块发生率达100%。
鸽喂饲胆固醇3g/kg/天，加甲基硫氧嘧啶0.1g，可以产生较多动物斑块。
2．免疫学方法：将大白鼠主动脉匀浆给兔注射，可引起血胆固醇、β-脂蛋白及甘油三脂升高。
给兔注射马血清10ml/kg/次，共4次，每次间隔17天，动脉内膜损伤率为88%，冠状动脉亦有粥样硬化的病变；同时给予高胆固醇饲料，病变更加明显。
１０６包头医学院学报ＪｏＵＲＮＡＬＯＦＢＡｏＴｏＵＭＥＤｌＣＡＬＣＯＬＬＥＧＥ２００９年第２５卷第６期Ｖ０１．２５Ｎｏ．６２００９ＣＤ４０系统与动脉粥样硬化的研究进展赵文卿王蒙琴（包头医学院第一附属医院，内蒙古包头１４０１０）动脉粥样硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ。
ＡＳ）的发病机制十分复杂，目前越来越多的研究表明炎症与免疫几乎贯穿整个动脉粥样硬化发生发展乃至斑块破裂的全过程【ｌ－２］，并对心脏缺血事件的发生和与此相关的致死、致残率有很大的影响。
在炎症反应中，一些细胞因子起着至关重要的作用，其中，白细胞分化抗原４０及其配体（ＣＤ４０－－ＣＤ４０Ｌ）信号通路在Ａｓ的炎症免疫调节中日益明确［３］。
本文旨在对ＣＤ４０系统与动脉粥样硬化的关系作一综述。
１ＣＩＭ０－－ＣＤ４０Ｌ系统ＣＤ４０（ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ４０）是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，分子量为４８ｋＤ的型跨膜蛋白，可表达于Ｂ细胞、血管活化的内皮细胞（ＥＣｓ）、胸腺上皮细胞、单核细胞等表面。
人ＣＤ４０基因位于２０ｑｌｌ一１３，其所编码蛋白产物含有２７７个氨基酸。
ＣＤ４０配体（ＣＤ４０ｌｉｇａｎｄ，ＣＤ４０Ｌ）亦即ＣＤｌ５４、ｇｐ３９是一种Ⅱ型跨膜蛋白，含２６１个氨基酸残基，其三维结构类似于肿瘤坏死因子口（ＴＮＦ—ａ），属于ＴＮＦ超家族中的细胞因子Ｈ］。
ＣＤ４０Ｌ以膜型和可溶性两种形式存在，都可与ＣＤ４０相互作用。
除了３９ｋＤ的模型，还有两种分子量更小的可溶形式（１８ｋＤ和３１ｋＤ），同样具有生物学活性．存在于未被激活的血小板内部的ＣＤ４０Ｌ在血小板激活后迅速表达于血小板表面，在几分钟或是几小时内被水解成可溶性片段脱落进入血循环，ＣＤ４０与ＣＤ４０Ｌ结合后可激活一些第二信使系统，激发ＮＦ—ＫＢ／Ｒｅｌ蛋白的活化，从而参与ＩｇＧ、ＩｇＡ及ＩｇＥ的类剃转换的转录机制，而促进免疫球蛋白的同种型转换。
…。
２ＣＤ４０—ＣＩＭＯＬ系统与ＡＳ２．１ＣＤ４０－－ＣＤ４０Ｌ系统在ＡＳ中的表达Ｇｅｒｒｉｔｓｅ等¨。
2194 环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October 2023,Vol.16,No.11㊃基础研究㊃基金项目:国家中医心血管病临床医学研究中心专项科研基金(CMC2022010);国家自然科学基金联合基金(U22A20372)作者单位:100029 北京中医药大学研究生院[路爱梅(硕士研究生)㊁李洪峥(博士研究生)㊁彭煜暄(硕士研究生)];中国中医科学院西苑医院心血管科[杨文文(博士研究生)㊁魏玥(硕士研究生)㊁曲华㊁付长庚],老年病科(龙霖梓);北京了未元中医药研究有限公司(吴汉涛)作者简介:路爱梅(1996-),2021级在读硕士研究生㊂研究方向:中西医结合心血管疾病研究㊂E⁃mail:570633591@ 通信作者:付长庚(1981-),博士,主任医师,博士生导师㊂研究方向:中西医结合心血管疾病研究㊂E⁃mail:fucgbs@化栓通脉方调节自噬抗动脉粥样硬化的实验研究路爱梅 李洪峥 杨文文 彭煜暄 魏玥 龙霖梓 曲华 吴汉涛 付长庚【摘要】 目的 观察化栓通脉方对ApoE 基因敲除(ApoE knockdown,ApoE -/-)小鼠动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的影响,并初步研究其抗AS 的作用机制㊂方法 10只8周龄C57BL /6J 小鼠设为对照组,全程普通饲料喂养;43只同品系ApoE -/-小鼠高脂饲料喂养8周制备体内AS 模型㊂造模成功后随机分为4组:模型组㊁辛伐他汀组(3mg /kg)㊁化栓通脉方低剂量组(6g /kg)㊁化栓通脉方高剂量组(12g /kg)㊂第9周各组开始相应药物灌胃,对照组和模型组采用等体积生理盐水,连续灌胃6周后分离血清和主动脉㊂使用全自动生化分析仪测定各组血清总胆固醇(total cholesterol,TC)㊁甘油三酯(triglyceride,TG)㊁低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL⁃C)㊁高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL⁃C)水平;采用ELISA 法检测各组血清白细胞介素(interleukin,IL)⁃1β㊁γ干扰素(interferon gamma,IFN⁃γ)㊁IL⁃10㊁IL⁃4水平;采用油红O 染色评价整体主动脉内膜斑块分布情况并测定相对斑块面积;采用苏木素 伊红染色评价主动脉窦斑块病理形态并量化斑块区域;采用Russell⁃Movat 染色分析小鼠主动脉窦斑块成分;采用免疫荧光染色检测小鼠主动脉窦组织溶酶体关联膜蛋白2(lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2)㊁轻链蛋白3A /B(light chain 3A /B,LC3A /B)㊁P62蛋白的表达㊂结果 化栓通脉方调节血脂效果较为突出,可明显降低AS 小鼠血清TC㊁TG㊁LDL⁃C 水平,提升HDL⁃C 水平,高㊁低剂量组都显示出显著的优势(P <0.01);相比于模型组,化栓通脉方高剂量组血清中IL⁃1β㊁IFN⁃γ含量显著降低,斑块面积㊁泡沫细胞和胶原纤维相对占比明显减小,P62蛋白表达显著减少,IL⁃10㊁IL⁃4含量显著升高,LAMP2㊁LC3A /B 表达明显增加,差异具有统计学意义(均P <0.05)㊂结论 化栓通脉方可显著调节AS 小鼠血脂和炎症因子水平,减少主动脉组织中泡沫细胞㊁胶原纤维和斑块的生成,通过促进LC3A /B㊁LAMP2的表达和P62的降解,调控细胞自噬,从而延缓AS 的发生发展㊂【关键词】 化栓通脉方; 动脉粥样硬化; 自噬; 降脂; 抗炎【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2023.11.006Experimental study of Huashuan Tongmai decoction regulating autophagy against atherosclerosis LU Aimei ,LI Hongzheng ,YANG Wenwen ,PENG Yuxuan ,WEI Yue ,LONG Linzi ,QU Hua ,WU Hantao ,FU ChanggengThe Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine ,Beijing 100029,China Corresponding author :FU Changgeng ,E⁃mail :fucgbs@【Abstract 】 Objective To observe the effect of Huashuan Tongmai decoction on atherosclerosis环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112195 (AS)in ApoE knockout(ApoE knockdown,ApoE-/-)mice,and to study the mechanism of action againstAS.Methods 108-week⁃old C57BL/6J mice were treated as the control group and fed general diet,and43ApoE-/-mice were fed high⁃fat diet for8weeks to prepare in vivo AS model.After successful modelmaking,they were randomly divided into4groups:model group,Simvastatin group(3mg/kg),low dosegroup(6g/kg),and high dose group(12g/kg)of Huashuan Tongmai decoction.On week9,the controlgroup and the model group were received volume saline intragastric administration,the other groups weretreated with the drug intragastric administration,and serum and aorta were obtained after continuous gavagefor6weeks.The serum levels of TC,TG,LDL⁃C,and HDL⁃C in each group were determined by an automatic biochemical analyzer;the serum levels of IL⁃1β,IFN⁃γ,IL⁃10,and IL⁃4in each group were measured by ELISA;oil red O staining was used to evaluate the overall aortic endometrial plaque distribution and determine the relative plaque area;the method of Hematoxylin⁃eosin(HE)staining wasused to evaluate the aortic sinus plaque pathological morphology and quantify the plaque areas;the plaque components of the mouse aortic sinus were analyzed by Russell⁃Movat staining;the expression of LAMP2,LC3A/B,and P62in mice aortic sinus tissues were detected by immunofluorescence staining.Results The effect of Huashuan Tongmai decoction was prominent,which could significantly decreased the levels ofTC,TG,and LDL⁃C,and increased the level of HDL⁃C in AS mice serum,both the high and the low dosegroups showed significant advantages(P<0.01);compared with the model group,the high dose groupwas decreased significantly in the levels of IL⁃1βand IFN⁃γ,plaque area,the relative proportion of foamcells and collagen fibers,and the expression of P62,meanwhile,increased significantly in the levels ofIL⁃10and IL⁃4,and the expression of LAMP2and LC3A/B(P<0.05).Conclusion Huashuan Tongmai decoction can significantly regulate serum lipids and inflammatory factors in AS mice,reduce the generationof foam cells,collagen fibers and plaques in aortic tissue,and regulate cell autophagy by promoting the expression of LC3A/B and LAMP2and depressing the expression of P62,thus delaying the occurrence and development of AS.【Key words】 Huashuan Tongma decoction; atherosclerosis; autophagy; lipid⁃lowering; anti⁃inflammation 2019年全球疾病负担研究结果表明,以缺血性心脏病和卒中为主的动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)是引起全球人口死亡的首要原因,占全球总死亡人数的三分之一[1],给人类健康带来严重的危害㊂动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是ASCVD的病理基础,其成因复杂,其中脂质代谢紊乱㊁免疫和炎症贯穿AS病变始终[2⁃3]㊂自噬是在自噬相关基因的调控下,利用溶酶体自我降解后再利用,维持细胞能量稳态的过程[4],对AS的调控更具有双向作用 在AS早期内皮通过自噬调节脂质代谢㊁减轻炎症反应,从而抑制斑块的形成,晚期随着斑块的进展而变得功能失调[5]㊂因此,维持自噬的动态平衡对抑制AS的恶性发展极为重要㊂化栓通脉方是本课题组根据临床治疗AS患者总结而来的经验方,用于改善冠状动脉㊁颈动脉粥样硬化斑块,临床疗效确切㊂但其在动物体内研究中,是否具有抗AS效应及其作用机制有待进一步研究㊂有鉴于此,本实验从血清脂蛋白㊁炎症因子㊁斑块面积等方面,综合评价化栓通脉方调节ApoE 基因敲除(ApoE knockdown,ApoE-/-)小鼠主动脉粥样硬化斑块的效应,并初步探索其是否通过调控自噬而发挥抗AS作用㊂1 材料与方法1.1 实验动物及实验环境8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠10只,同品系ApoE-/-小鼠43只,体质量(22±2)g,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司[许可证号:SCXK(京) 2019⁃0010]㊂小鼠饲养于北京了未元医药科技公司动物实验中心[许可证号:SYXK(京)2022⁃0007],温度(22±2)℃,湿度(50±10)%,明/暗周期(12/12)小时㊂动物自由进食㊁饮水㊂动物伦理审查批号:SYXK2022⁃0007㊂高脂饲料(83.5%基础饲料+15%猪油+1.5%胆固醇)和普通饲料均由北京华阜康生物科技有限公司[许可证号:SCXK(京)2019⁃0008]提供㊂实验过程中,动物灌胃致死3只,剔除各组离群2196 环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.11值,各组统计数量均为7只㊂1.2 实验药物辛伐他汀片(杭州默沙东制药有限公司,规格:20mg/片,批号:U04517)㊂化栓通脉方药物组成及剂量:金银花15g㊁山楂15g㊁鸡血藤15g㊁制何首乌15g㊁生白芍7.5g㊁生甘草4g㊂中药饮片皆购于九州通医药集团股份有限公司,经北京中医药大学吴嘉瑞教授鉴定,均符合2020版‘中国药典“要求㊂辛伐他汀片用生理盐水配置成混悬液,浓度为0.3mg/mL㊂化栓通脉方各药物按组方比例,称取715g,用2000mL蒸馏水煎煮2次,然后浓缩至715mL的中药混悬液,每毫升含生药量1g,浓度为1g/mL,4℃保存,备用㊂用药剂量参考公式:高剂量给药剂量=成人(70kg)临床常用量×12(按人 小鼠体表面积折算等效剂量系数)㊂以成人(70kg)每日金银花15g㊁山楂15g㊁鸡血藤15g㊁制何首乌15g㊁生白芍7.5g㊁生甘草4g,共71.5g,生药计算高剂量组小鼠每日等效剂量为12g/kg,高㊁低剂量组给药剂量按2∶1设置,低剂量组小鼠每日给药剂量为6g/kg㊂辛伐他汀片成人给药剂量为每日20mg,换算获得辛伐他汀组小鼠每日灌胃剂量为3mg/kg㊂1.3 主要试剂与仪器白细胞介素(interleukin,IL)⁃1β㊁γ干扰素(interferon gamma,IFN⁃γ)㊁IL⁃10㊁IL⁃4ELISA试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司,批号分别为EK201BHS⁃96㊁EK280/3⁃96㊁EK210/4⁃96㊁EK204HS⁃96);油红O染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号G1016);苏木素 伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号G1120);Russell改良Movat五色染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号G3701);抗⁃SQSTM1/ P62兔pAb㊁抗⁃LAMP2兔pAb㊁抗LC⁃3A/B兔pAb (武汉赛维尔生物科技有限公司,批号分别为GB11239⁃1㊁GB11330㊁GB11124)㊂台式高速冷冻离心机(大龙,型号D3024R),酶标检测仪(美国BioTeK公司,型号Epoch),全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技,型号分别为Chemray240㊁420㊁800),荧光显微镜(宁波舜宇仪器有限公司,型号2204926),光学显微镜(DMi1,型号Leica),组织切片机(浙江省金华市科迪仪器公司,型号KD⁃ST5500)㊂1.4 动物分组㊁给药及取材适应性喂养1周,10只C57BL/6J小鼠作为对照组,全程采用普通维持饲料喂养㊂43只ApoE⁃/⁃小鼠采用高脂饲料喂养8周后,随机抽取3只取材,主动脉窦病理切片HE染色显示:主动脉管腔狭窄,内膜明显增厚,有明显斑块形成,提示早期AS体内模型建立成功㊂造模后的ApoE-/-小鼠随机分为4组:模型组㊁辛伐他汀组(3mg/kg)㊁化栓通脉方低剂量组(6g/kg)㊁化栓通脉方高剂量组(12g/kg),每组10只,继续高脂饲料喂养,用药组同时予以相应药物灌胃,对照组和模型组予等体积生理盐水灌胃以保证组间一致性,每日灌胃1次,连续6周㊂最后一次灌胃后,禁食㊁不禁水12小时㊂用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉,球后静脉(眼眶静脉丛)取血,室温静置2小时,4℃4000r/min离心10分钟,分离上层血清,-80℃下冻存㊂取血后打开小鼠胸腔及腹腔,经PBS充分灌流,整体分离自主动脉根部至髂总动脉分叉处主动脉,并剥离周围多余结缔组织和脂肪组织,投入液氮或组织固定液中保存,用于后续相关实验㊂1.5 指标检测1.5.1 酶标法测定小鼠血脂水平 每组取7只小鼠,使用全自动生化分析仪测定各组小鼠血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)㊁甘油三酯(triglyceride,TG)㊁低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL⁃C)㊁高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL⁃C)的水平㊂1.5.2 ELISA法检测血清炎症因子水平 每组取7只小鼠,根据ELISA试剂盒说明书操作,检测小鼠血清中IL⁃1β㊁IFN⁃γ㊁IL⁃10㊁IL⁃4的水平㊂1.5.3 大体油红O染色测定整体主动脉相对斑块面积 每组取3只小鼠,在光学显微镜下将小鼠主动脉纵剖面固定,水洗,油红O染色后将血管平铺于黑色橡胶板,迅速拍照,利用Image J软件分析以主动脉相对斑块面积来评价主动脉斑块严重程度㊂相对斑块面积(%)=主动脉斑块面积/血管内膜总面积×100%㊂1.5.4 HE染色评价主动脉窦病理形态 每组取3只小鼠,4%多聚甲醛固定主动脉于4℃冰箱24小时,梯度脱水后石蜡包埋,并连续切片(5μm),HE 常规染色后封片拍照,于光学显微镜下检测AS小鼠主动脉窦病理形态的变化,测量并计算斑块面积占血管内膜面积百分比㊂相对斑块面积(%)=斑块环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112197面积/内膜总面积×100%㊂1.5.5 Russell⁃Movat染色评价主动脉窦斑块成分 每组取3只小鼠,主动脉石蜡切片处理,切片厚度5μm,连续切片至观察到3个主动脉瓣完全融合开始留取10张切片,切片脱蜡至水,经五色法染液进行染色,脱水封片,在光学显微镜下观察主动脉窦斑块各成分变化,染色后的细胞核和弹性纤维呈黑色,胶原纤维呈红色,泡沫细胞呈淡紫色,蛋白聚糖呈蓝色㊂测量并计算斑块内泡沫细胞及胶原纤维的占比㊂1.5.6 免疫荧光法评价主动脉窦溶酶体关联膜蛋白2(lysosomal associated membrane protein2, LAMP2)㊁轻链蛋白3A/B(light chain3A/B,LC3A/ B)㊁P62蛋白的表达 每组取3只小鼠,主动脉窦石蜡切片,常规脱蜡㊁水化㊁抗原修复后,血清室温封闭30分钟,滴加一抗4℃孵育过夜,PBS浸洗3次,次日滴加荧光二抗25℃避光孵育1小时,PBS浸洗3次,滴加DAPI避光孵育5分钟复染细胞核,PBS 浸洗4次,最后用含抗荧光的淬灭剂封片㊂使用荧光显微镜观察主动脉窦的LAMP2㊁LC3A/B㊁P62蛋白荧光表达,并采集图像,利用Image J分析处理数据㊂1.6 统计学方法实验所得数据为计量资料,使用SPSS24.0统计软件进行处理㊂数据经检验均符合正态分布且方差齐,以均数±标准差(x±s)表示㊂多组间比较采用单因素方差分析,两两比较用LSD法,P<0.05表示差异具有统计学意义㊂2 结果2.1 化栓通脉方对小鼠血脂水平的影响相比于对照组,模型组小鼠血清中TC㊁TG㊁LDL⁃C水平明显升高,HDL⁃C水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);相比于模型组,辛伐他汀组和化栓通脉方低㊁高剂量组血清中TC㊁TG㊁LDL⁃C水平均显著降低,HDL⁃C水平均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)㊂见表1㊂2.2 化栓通脉方对小鼠血清炎症因子水平的影响与对照组相比,模型组血清中IL⁃1β㊁IFN⁃γ含量显著上升,差异具有统计学意义(P<0.01), IL⁃10㊁IL⁃4含量也有所升高,但无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,化栓通脉方高剂量组血清中IL⁃1β㊁IFN⁃γ含量显著降低,IL⁃10㊁IL⁃4含量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);化栓通脉方低剂量组较模型组IFN⁃γ含量降低,IL⁃4含量升高,差异有统计学意义(P<0.01),IL⁃1β含量降低, IL⁃10含量升高,差异无统计学意义(P>0.05)㊂见表2㊂表1 各组AS模型小鼠血脂水平比较(x±s,mmol/L)组别鼠只TC TG LDL⁃C HDL⁃C对照组7 2.75±0.160.66±0.030.36±0.03 1.99±0.10模型组724.74±0.96b 4.17±0.34b15.28±1.50b 1.43±0.30a 辛伐他汀组717.88±2.90bc 2.21±1.07bc11.13±1.66bc 2.96±0.82bc 化栓通脉方低剂量组718.74±2.23bc 2.06±0.45bc11.82±2.23bc 2.83±0.31bc 化栓通脉方高剂量组718.21±1.37bc 1.44±0.35ac10.17±2.16bc 3.39±0.52bc 注:与对照组相比,a P<0.05,b P<0.01;与模型组相比,c P<0.01㊂表2 各组AS模型小鼠血清炎症因子比较(x±s,pg/mL)组别鼠只IL⁃1βIFN⁃γIL⁃10IL⁃4对照组70.61±0.3153.44±21.3435.66±18.26 1.30±0.31模型组7 5.97±1.65a214.70±87.64a72.92±28.44 2.89±0.85辛伐他汀组7 3.93±2.06ab129.80±95.78b90.36±28.06a7.64±5.92化栓通脉方低剂量组7 4.79±2.05a61.71±21.39b93.33±33.28a11.81±4.02ab 化栓通脉方高剂量组7 2.03±0.74b61.89±23.34b140.80±59.54ab22.24±7.69ab 注:与对照组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.01㊂2198 环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112.3 化栓通脉方对小鼠整体主动脉斑块面积的影响主动脉大体油红O染色显示,对照组小鼠主动脉血管壁大体光滑㊁平整,呈半透明状,见有少量点状斑块散在分布;高脂饲料喂养14周,模型组小鼠主动脉管腔病理性扩增,管壁存在大量的红染的点片状脂质斑块,且多分布在主动脉弓及血管分叉处㊂相比对照组,模型组主动脉窦部斑块面积明显增加(P<0.01);相比模型组,化栓通脉方低㊁高剂量组小鼠主动脉窦部斑块面积均明显减少(P<0.01)㊂见图1及表3㊂2.4 化栓通脉方对小鼠主动脉窦病理形态的影响主动脉窦HE染色显示,对照组小鼠主动脉内膜光滑完整,内膜下无明显泡沫细胞和脂质沉积形成,中层平滑肌细胞排列整齐;模型组小鼠主动脉内膜增厚明显,内膜下可见大量泡沫细胞和脂质沉积,中层平滑肌细胞增殖且排列紊乱;与模型组相比,化栓通脉方高剂量干预后,小鼠主动脉窦内膜厚度㊁泡沫细胞数量及脂质沉积明显减轻(P<0.01)㊂见图2,表4㊂表3 各组小鼠AS模型小鼠斑块面积占比(大体油红O染色)(x±s)组别鼠只主动脉相对斑块面积占比(%)对照组3 1.98±0.98模型组312.55±4.05a辛伐他汀组3 2.65±0.99b化栓通脉方低剂量组3 6.46±3.31b化栓通脉方高剂量组3 2.75±0.29b注:与对照组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.01㊂注:A对照组;B模型组;C辛伐他汀组;D化栓通脉方低剂量组;E化栓通脉方高剂量组㊂图1 各组AS模型小鼠主动脉大体油红O染色结果注:A对照组;B模型组;C辛伐他汀组;D化栓通脉方低剂量组;E化栓通脉方高剂量组㊂图2 各组AS模型小鼠主动脉窦HE染色结果(×100)环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112199表4 各组小鼠AS模型小鼠斑块面积及成分占比(x±s)组别鼠只主动脉窦相对斑块占比(HE染色,%)泡沫细胞占比(Movat染色,%)胶原纤维占比(Movat染色,%)对照组3000模型组351.00±4.00a17.00±2.00a18.33±2.08a 辛伐他汀组336.80±1.76ab12.00±2.94ab9.75±3.50ab 化栓通脉方低剂量组332.40±7.96ab13.80±3.56a11.33±0.58ab 化栓通脉方高剂量组325.67±10.40ab11.00±4.00ab8.33±1.53ab 注:与对照组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.01㊂ 主动脉窦Russell⁃Movat染色结果显示,对照组内膜未见明显斑块,内皮细胞结构完整,弹力纤维弯曲连续,富有弹性,中膜血管平滑肌排列整齐,周围分布少量胶原纤维和网状纤维结构;模型组可见内膜斑块显著突向管腔,斑块内部有大量泡沫细胞和脂质堆积,斑块表面有大量炎症细胞浸润黏附,平滑肌细胞大量增生,排列紊乱,血管中膜失去连续性,弹力纤维绷直㊁失去弹性,胶原纤维㊁网状纤维排布错乱㊂化栓通脉方干预后主动脉窦Movat染色显示:斑块炎症细胞浸润黏附有所减轻,脂质堆积有所减少,胶原纤维结构稳定,覆盖包裹在脂质表面,血管中膜连续性较模型组有所改善(P<0.05),表明化栓通脉方促进斑块稳定,减少AS的发展㊂见图3,表4㊂2.5 化栓通脉方对小鼠主动脉窦自噬相关蛋白表达的影响免疫荧光结果显示,与对照组相比,模型组小鼠主动脉中LAMP2㊁LC3A/B㊁P62的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,化栓通脉方高剂量干预后,AS模型小鼠主动脉窦中LAMP2㊁LC3A/B表达升高(P<0.01),P62的表达降低(P>0.05)㊂见图4,表5㊂3 讨论在AS的中医药防治中,瘀与毒是导致易损斑块形成及破裂的主要病理因素㊂稳定斑块和血栓属于 内阻瘀血”,各种炎症因子属于 内生毒邪”,瘀为常,毒为变,由常生变,因瘀致毒,毒瘀互结,AS 易损斑块在瘀血基础上 毒邪”致病,治当以解毒化瘀[6⁃9]㊂化栓通脉方以金银花为君,解毒清热,直击病本;山楂行气散瘀化浊,鸡血藤祛瘀养血通络,制何首乌㊁白芍养血益精,敛阴止痛,共为臣药;甘草清热解毒,调和诸药㊂上述药物合用,共奏解毒化瘀㊁养血通络之效㊂注:A对照组;B模型组;C辛伐他汀组;D化栓通脉方低剂量组;E化栓通脉方高剂量组㊂图3 各组AS模型小鼠主动脉窦Movat染色结果(×100)表5 各组AS模型小鼠主动脉窦自噬蛋白表达情况比较(x±s)组别鼠只P62LC3A/B LAMP2对照组3 1.98±0.987.04±0.2938.23±8.04模型组312.55±4.05b10.60±2.7866.13±16.30a 辛伐他汀组3 2.65±0.99ac14.27±3.93b108.60±15.36bc 化栓通脉方低剂量组3 6.46±3.31b8.66±0.6573.54±8.85b 化栓通脉方高剂量组3 2.75±0.29b17.05±2.34bc109.80±8.34bc 注:与对照组相比,a P<0.05,b P<0.01;与模型组相比,c P<0.01㊂2200 环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October 2023,Vol.16,No.11注:A 对照组;B 模型组;C 辛伐他汀组;D 化栓通脉方低剂量组;E 化栓通脉方高剂量组㊂图4 各组AS 模型小鼠主动脉窦免疫荧光染色结果(×100) 现代药理学研究指出,化栓通脉方通过多成分㊁多靶点㊁多途径,发挥抗AS 作用 金银花㊁山楂㊁鸡血藤㊁白芍都具有抗炎㊁抗氧化㊁抗血小板聚集的作用[10⁃12],山楂还可调节血脂代谢及改善血管内皮功能,鸡血藤可调节造血系统[13⁃14],制何首乌可补血㊁抗衰老㊁降血脂[15],白芍可通过调节免疫㊁抑制细胞凋亡㊁促进胆固醇流出等途径抗AS [16⁃17]㊂由此可知,化栓通脉方中药物成分可能通过抑制斑块内炎症反应㊁改善脂质代谢和血流动力学,从而降低斑块恶化破裂风险㊂故本研究旨在通过探讨化栓通脉方对ApoE -/-小鼠抗AS 的作用及其机制,为其临床应用提供理论依据和数据支撑㊂3.1 化栓通脉方通过降脂㊁抗炎实现抗AS 作用AS 是一种慢性炎症性血管疾病,脂质代谢紊乱与炎症因子升高会导致血管内皮功能受损,引起血管内壁脂质堆积及斑块和血栓的形成,与AS 的生成与发展密切相关[3,18],促炎和抗炎机制的平衡决定着AS 的结局,是病情转化和恶化的关键[19]㊂有鉴于此,调节血脂代谢㊁抑制炎症反应在AS 的治疗中占有重要地位㊂本研究表明,化栓通脉方可调节血清脂蛋白㊁炎症因子水平㊂研究结果指出,相比于模型组,高㊁低剂量化栓通脉方组血清中TC㊁TG㊁LDL⁃C 水平均显著下降,HDL⁃C 水平显著上升,促炎因子IL⁃1β㊁IFN⁃γ含量降低,抑炎因子IL⁃10㊁IL⁃4含量升高,斑块面积㊁泡沫细胞和胶原纤维相对占比明显减小,且随化栓通脉方浓度升高而存在一定差异㊂由此表明,化栓通脉方可能通过调节血脂代谢㊁降低血清炎症因子水平,减少主动脉斑块面积,实现抗AS 作用㊂3.2 化栓通脉方抗AS 作用可能与诱导细胞自噬有关自噬是细胞自身的分解代谢机制,对AS 具有重要影响,其水平主要通过自噬标志物(自噬体和自噬溶酶体)和自噬蛋白标志物的水平进行评价[20⁃21]㊂自噬体作为自噬过程的标志性结构,是检测自噬的唯一金标准,而LC3是最可靠的自噬体标志物,其表达水平与自噬体数量呈正相关;LAMP2是溶酶体标志物,其表达水平与自噬溶酶体亦呈正相关;P62是自噬的特异性底物,其表达水平与自噬潮呈负相关㊂本研究免疫荧光结果显示,模型组较对照组具有高水平的LC3A /B㊁LAMP2共定位,表明自噬的募集是对新兴斑块的应激反应㊂化栓通脉方组较模型组LC3A /B㊁LAMP2的表达上调㊁P62的表达下调,且高剂量组比低剂量组自噬蛋白表达更为显著,表明化栓通脉方可增加自噬通量,升高自噬水平,起到抗AS 作用,并与剂量呈相关关系㊂综上所述,化栓通脉方可能通过诱导细胞自环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112201噬,调节脂质代谢㊁减弱炎症反应,从而抑制斑块形成与进展,达到防治AS的作用,具体机制通路有待进一步实验验证㊂参考文献[1] Roth G A,Mensah G A,Johnson C O,et al.Global burden ofcardiovascular diseases and risk 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