绿色荧光蛋白

绿⾊荧光蛋⽩

绿⾊萤光蛋⽩（Green fluorescent protein；简称GFP），由下村脩等⼈于1962年在维多利亚多

管发光⽔母中发现，其基因所产⽣的蛋⽩质，在蓝⾊波长范围的光线激发下，会发出绿⾊萤

光，整个发光的过程中还需要冷光蛋⽩质⽔母素的帮助，冷光蛋⽩质与钙离⼦（Ca2+）可产⽣

交互作⽤。2008年10⽉8⽇，⽇本科学家下村脩、美国科学家马丁·查尔菲和钱永健因为发现和

改造绿⾊荧光蛋⽩获得了诺贝尔化学奖。绿⾊萤光蛋⽩现常被⽤来研究⾻架和细胞分裂、动⼒

学和泡囊运输、发育⽣物学等，并可应⽤于转染细胞的确定、体内基因表达的测定、蛋⽩质分

⼦的定位、细胞间分⼦交流的动态监测等。

基本信息

中⽂名：绿⾊荧光蛋⽩

英⽂名：green fluorescent protein

别名：GFP

发现者：下村修

相关推荐

慢病毒

BSA

dsDNA

考马斯亮蓝

CD34

载体蛋⽩

载体

GAPDH

cDNA⽂库

免疫荧光

PCR

热休克蛋⽩

鸟枪法

shRNA

显影液

断裂基因

同源重组

酵母双杂交

宏基因组

透射电镜

构造组成

正在加载科学家在线形⾍体内植⼊绿⾊荧光蛋⽩质

由⽔母Aequorea victoria中发现的野⽣型绿⾊荧光蛋⽩

，395nm和475nm分别是最⼤和次⼤的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光

绿光的范围下是较弱的位置。由海肾（sea pansy）所得的绿⾊荧光蛋⽩，仅有在498nm有⼀个

较⾼的激发峰点。

在细胞⽣物学与分⼦⽣物学领域中，绿⾊荧光蛋⽩基因常被⽤作为⼀个报导基因(reportergene）。⼀些经修饰过的型式可作为⽣物探针，绿⾊荧光蛋⽩基因也可以克隆到脊椎动物（例

如：兔⼦上进⾏表现，并拿来映证某种假设的实验⽅法。

蛋⽩作⽤

绿⾊荧光蛋的发光机理⽐荧光素/荧光素酶要简单得多。⼀种荧光素酶只能与相对应的⼀种荧光

素合作来发光，⽽绿⾊荧光蛋⽩并不需要与其他物质合作，只需要⽤蓝光照射，就能⾃⼰发

光。

在⽣物学研究中，科学家们常常利⽤这种能⾃⼰发光的荧光分⼦来作为⽣物体的标记。将这种荧光分⼦通过化学⽅法挂在其他不可见的分⼦上，原来不可见的部分就变得可见了。⽣物学家

⼀直利⽤这种标记⽅法，把原本透明的细胞或细胞器从⿊暗的显微镜视场中“揪出来”。

传统的荧光分⼦在发光的同时，会产⽣具有毒性的氧⾃由基，导致被观察的细胞死亡，这叫

做“光毒性”，因此，在绿⾊荧光蛋⽩发现以前，科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态

结构，⽽绿⾊荧光蛋⽩的光毒性⾮常弱，⾮常适合⽤于标记活细胞。

然⽽，绿⾊荧光蛋⽩被发现20多年后，才有⼈将其应⽤在⽣物样品标记上。1993年，马丁·沙尔

菲成功地通过基因重组的⽅法使得除⽔母以外的其他⽣物(如⼤肠杆菌等）也能产⽣绿⾊荧光蛋

⽩，这不仅证实了绿⾊荧光蛋⽩与活体⽣物的相容性，还建⽴了利⽤绿⾊荧光蛋⽩研究基因表

达的基该⽅法，⽽许多现代重⼤疾病都与基因表达的异常有关。⾄此，⽣物医学研究的⼀场“绿

⾊⾰命”揭开了序幕。

后来，美籍华⼈钱永健系统地研究了绿⾊荧光蛋⽩的⼯作原理，并对它进⾏了⼤⼑阔斧的化学

改造，不但⼤⼤增强了它的发光效率，还发展出了红⾊、蓝⾊、黄⾊荧光蛋⽩，使得荧光蛋⽩

真正成为了⼀个琳琅满⽬的⼯具箱，供⽣物学家们选⽤。⽬前⽣物实验室普遍使⽤的荧光蛋

⽩，⼤部分是钱永健改造的变种。

有了这些荧光蛋⽩，科学家们就好像在细胞内装上了“摄像头”，得以实时监测各种病毒“为⾮作

⽍”的过程。通过沙尔菲的基因克隆思路，科学家们还培育出了荧光⽼⿏和荧光猪，由于沙尔菲

与钱永健的突出贡献，他们与绿⾊荧光蛋⽩的发现者下村修共享了2008年的诺贝尔化学奖。

瑞典皇家科学院将绿⾊荧光蛋⽩的发现和改造与显微镜的发明相提并论，成为当代⽣物科学研

究中最重要的⼯具之⼀。

蛋⽩应⽤

⾻架和细胞分裂

Kevin Sullivan's 实验室

酵母菌内SPB 和微管动⼒学

酵母菌中肌动蛋⽩的动⼒

果蝇中MEI-S332蛋⽩

果蝇有丝分裂和mRNA运输

⽹丙菌属细胞⾻架

正在加载绿⾊荧光蛋⽩应⽤

RNA剪切因⼦的核内运输

⽹丙菌属的趋化作⽤

⽹丙菌属中细胞⾻架动⼒和细胞运动

核动⼒

⽹丙菌属中细胞动⼒

细胞⾻架动⼒和胞内运输

动⼒学和泡囊运输

⽤GFP显⽰⼩囊运输

⽤GFP观察TGN运输

细胞⾻架动⼒学和胞内运输

发育⽣物学

⽤GFP观察线⾍的神经发育分析果蝇神经发育的不对称性细胞分裂

线⾍Lin-14

Fischbach lab

⽤GFP观察⽹丙菌属的形态发⽣学

GFP在⼩⿏发育中的标记⽅法

⽣物技术中的应⽤研究

1．分⼦标记

正在加载GFP标记的微管

作为⼀种新型的报告基因，GFP已在⽣物学的许多研究领域得到应⽤。利⽤绿⾊荧光蛋⽩独特

的发光机制，可将GFP作为蛋⽩质标签（protein tagging），即利⽤DNA重

组技术，将⽬的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进⾏表达，然后借助荧光显微

镜便可对标记的蛋⽩质进⾏细胞内活体观察。由于GFP相对较⼩，只有238个氨基酸，将其与其

他蛋⽩融合后不影响⾃⾝的发光功能，利⽤GFP的这⼀特性已经加深了我们对细胞内⼀些过程

的了解，如细胞分裂、染⾊体复制和分裂，发育和信号转导等。1996年，Ehrdardt等⼈⾸次报

道了利⽤GFP的特性研究细胞分化蛋⽩FtsZ的定位。研究显⽰FtsZ在细胞分裂位点形成了⼀个

环状物，且⾄少有9种蛋⽩在细胞分裂中起重要作⽤，尽管对这些蛋⽩功能仍然不是很清楚，但

是利⽤GFP融合蛋⽩已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋⽩定位中的⼀些特征。利⽤GFP来

检测⽬标蛋⽩的定位已为我们提供了⼀种对细胞内的⼀些基本的⽣理过程进⾏更详尽观察的新

⽅法。

除⽤于特定蛋⽩的标记定位外，GFP亦⼤量⽤于各种细胞器的标记如细胞⾻架、质膜、细胞核

等等。Shi等⼈曾报道将GFP融合到⼤肠杆菌细胞膜表⾯⽤作标记蛋⽩，这⼀技术将有助于提⾼

多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞⽣物传感器⽤作环境检测以及探测信号转导过程等

等。这些都为传统⽣物学研究提供了新思路和新⽅法，成为交叉学科研究的热点。

正在加载c为药物筛选的GFP

许多新发展的光学分析⽅法已经开始利⽤活体细胞来进⾏药物筛选，这⼀技术能从数量众多的

化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密

度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究⽬标蛋⽩如受体、离⼦通道或酶的状态的变化。荧

光

探针分布是利⽤信号传导中信号分⼦的迁移功能，将⼀荧光蛋⽩与信号分⼦相偶联，根据荧光

蛋⽩的分布情况即可推断信号分⼦的迁移状况，并推断该分⼦在迁移中的功能。由于GFP分⼦

量⼩，在活细胞内可溶且对细胞毒性较⼩，因⽽常⽤作荧光探针。

在细胞体内分⼦之间的相互作⽤⾮常复杂，其中很多涉及到信号分⼦在细胞器之间的迁移。例

如当信号分⼦和某⼀特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某⼀细胞区域迁移到另⼀区

域，⽽这⼀迁移过程通常会介导⼀重要的⽣理功能。因⽽，这些受体常常被⽤作药物筛选的⽬

标，若某⼀药物具有与信号分⼦类似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利⽤GFP荧

光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断出哪些化合物具有与信号分⼦相似的能引起配体

⼀受体复合物迁移并介导⽣理反应的功能，且这⼀筛选过程简单⽅便，所需成本也很低。利⽤

这⼀原理，已经成功构建了⼀个筛选模型⽤于研究药物介导的糖⽪质激素受体(hGR）的迁移过

程。在⼀96孔板中培养细胞，并以⼀编码hGR GFP蛋⽩的质粒转染该细胞。当细胞⽤待筛选的

药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移⼈细胞核的过程可实时或在某⼀时段内被证实，根据荧光

分布即可推断哪⼀种药物具有与hGR配体相类似的功能。利⽤GFP来进⾏药物筛选由于受其必

须与迁移的信号分⼦相偶联，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特

的发光机制，因⽽在药物筛选中具有相当⼤的应⽤潜⼒。

3．融合抗体

正在加载线粒体中表达的GFP

近⼆⼗年来，抗体⽣成技术有了飞速发展，已经从细胞⼯程抗体（杂交瘤技术⼀单克隆抗体）

发展到了第三代抗体：基因⼯程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，解决了⼈源抗体的研

制问题，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋⽩的开发。单链抗体（Single-chain v

ariable fragment，ScFv）是研究得较多的⼀种⼩分⼦抗体，其优越性在于可在宿主细胞内⼤量

表达，易于基因⼯程操作，尤其易于构建抗体融合蛋⽩。关于绿⾊荧光蛋⽩融合单链抗体的报

道很多，国内也有相关报道，如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并

导⼈⼩⿏成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特

性，故这⼀⼈⼯分⼦可⽤做免疫染⾊的检测试剂，直接应⽤于流式细胞仪和免疫荧光的标记及

肿瘤的检测等等。

由于技术上的的原因，⼀般融合抗体均置于原核表达系统如E.coli中表达。为便于表达蛋⽩的分

离纯化，⼀般在单链抗体的N端或C端插⼊⼀6×His序列，便于⽤Ni-NTA亲和层析柱纯化⽬标蛋

⽩。但这⼀技术也存在⼀些问题。由于抗体分⼦内存在⼆硫键，⽽在原核表达系统内由于抗体

不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的⽬标蛋⽩⽆活性，需要在氧化还原体系中进⾏复

性。但也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体。若能成功解决

融合抗体的表达问题，则在免疫染⾊及肿瘤检测这⼀领域融合抗体将扮演极为重要的⾓⾊。

正在加载GFP在植物研究中的应⽤

蛋⽩质⼯程技术已经开始采⽤将⼀具有信号传导功能分⼦识别位点的分⼦结合到另⼀分⼦上来

设计⽣物感受器。绿⾊荧光蛋⽩由于其独特的光信号传导机制，以及在表达后易被周围化学环

境和蛋⽩之间的相互作⽤所影响的特性，因⽽极适于⽤做活细胞体内的光学感受器。第⼀个基

于GFP的⽣物感受器为Ca2+感受器，由Romoser和Miyawaki⼏乎同时提出。这⼀感受器原理是

利⽤钙调蛋⽩结合钙离

⼦后引起的空间构象变化导致两种GFP突变体间发⽣荧光共振能量转移。但是由于⼤多数蛋⽩

不能像钙调蛋⽩那样承受较⼤的空间构象变化，为克服这⼀缺点，⼈们开始提出利⽤基因融合

技术将⼀新的分⼦识别位点结合到GFP上以构建新的分⼦感受器。Doi和Yanagawa根据这⼀原

理将TEM1 β-内酰胺酶(Bla）融合到GFP上。当缺少⽬标分⼦时，GFP处于静⽌状态不会产⽣荧

光。但是当⽬标分⼦β-内酰胺酶抑制蛋⽩（BLIP）与Bla结合后，即使GFP活化产⽣荧光，⽽这

⼀变化很容易被检测到。将受体蛋⽩插⼊到GFP表⾯的技术已经成为构建分⼦感受器的有⼒⼯

具，这种GFP感受器能被⽤来检测多种分⼦，如蛋⽩质、核酸、激素、药物、⾦属及其他的⼀

些⼩分⼦化合物等，其潜在应⽤前景极为⼴阔。

肿瘤发病机制的应⽤

正在加载将绿黄红荧光蛋⽩质植⼊鱼的DNA分⼦

结构中

GFP是⼀个分⼦量较⼩的蛋⽩，易与其他⼀些⽬的基因形成融合蛋⽩且不影响⾃⾝的⽬的基因

产物的空间构象和功能。GFP 与⽬的基因融合，将⽬的基因标记为绿⾊，即可定

量分析⽬的基因的表达⽔平，显⽰其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿

瘤发⽣、发展中的作⽤及其分⼦机制提供便利条件。

在肿瘤的形成过程中，增殖和凋亡是⼀对相互⽭盾的统⼀体。若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组

织将长期处于休眠状态或⾃⾏消亡。肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。⽤GFP转染肿瘤细

胞凋亡相关基因，并与正常组织进⾏⽐较，则⼤致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因；

反之，为促进肿瘤细胞凋亡的基因。

肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等⼀系列过程的表现，其根本原因

在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利⽤GFP 的⽰踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达

与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭⽰肿瘤细胞浸润的某些机制。

在信号转导中的应⽤

新近研究发现，某些突变的 GFP 能够发⽣荧光共振能量转移 (fluorescence resonance energytransfer,FRET）。FRET 是⼀种从荧光分⼦的激发状态到临近基态接受分⼦之间量⼦⼒学能量