细胞工程授课讲义

细胞工程授课讲义参考书目：细胞工程，李志勇主编，科学出版社，2003年第一版动物细胞工程，徐永华主编，化学工业出版社，2003年第一版01绪论1.1生物工程1.1.1 定义: 生物工艺学,生物技术,是以生命科学为基础,利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术,或利用生物有机体(从微生物直至高等动物)或其组成部分(器官组织细胞)发展新工艺或制造新产品的一种科学技术.1.1.2 发展简史1.1.2.1 第一代生物工程1680列文虎克制成显微镜1857巴斯克证实酒精是由活酵母引起的乳酸、酒精、面包酵母、丙酮、柠檬酸、淀粉酶1.1.2.2近代生物工程青霉素：1928年弗莱明发现，1940年弗洛里和钱恩人工提取，1943年开发出沉浸培养工艺。

特点：产品类型多；技术要求高；好气发酵；规模大1.1.2.3现代生物工程1953年沃森和克里克双螺旋结构1974年美国的波依尔和科恩实现基因重组运用DNA重组技术、细胞融合技术开发出DNA重组产品：干扰素、胰岛素、生长激素等，以及转基因生物和克隆动物1.1.3生物工程特点组成生物、化学、工程学关系－图1－1生物工程6类关系图1－21.1.3.1发酵过程:利用微生物的特定性状通过现代工程技术，在生物反应器中生产有用物质的一种技术。

传统发酵过程与现代生物工程结合形成微生物工程，利用对象除微生物外，还有动植物细胞、重组细胞、基因工程菌。

1.1.3.2酶工程：利用酶的催化作用，采用适当的生物反应器工业化的生产人类所需产品或是达到某一特殊目的的一门生物技术。

1.1.3.3蛋白质工程：利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造并分离纯化蛋白质从而获取自然界没有的，具有优良性质或是用于工业生产条件的全新的蛋白质技术。

1.1.3.4基因工程：即重组DNA技术，是根据人们的意愿对不同事物的生物遗传性状的生物类型的一门技术.1.1.3.5生化工程:是有生物科学与化学工程相结合的交叉学科,主要研究生物技术的实验室成果转化为生产力过程带有共性的工程技术问题,是生物技术的一个组成部份.1.2 细胞工程1.2.1 定义:应用细胞生物学和分子生物学的方法,通过类似于工程学的步骤,在细胞整体水平和细胞器水平上,按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质,以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术.研究对象:染色体、细胞核、原生质体、整个细胞、受精卵、胚胎、组织或器官，以及转基因动物。

1.2.2细胞工程发展历史马勒等发现多核现象植物界，1902年哈珀兰德预言植物细胞全能性；1934年温特发现生长素；1937年高特里特离体培养胡罗卜；1960年科金制备原生质体1972年卡尔森将烟草原生质体细胞融合成体细胞杂种植株。

动物界：1907年哈里森悬滴培养蛙胚神经组织；1965年哈里斯用灭活病毒介导动物细胞融合。

耶鲁大学的马格特和波的斯利－黑白黄组装鼠绵羊－山羊－绵山羊1977年英国第一例试管婴儿1997年英国克隆羊多莉2001年英国首批转基因克隆猪我国杂交水稻、三倍体毛白杨、转基因鱼、试管婴儿、动物体细胞克隆。

1.2.3研究内容动植物细胞与组织培养：优良植物的快速繁育与代谢产物的大量制备。

细胞融合：产生新的物种或品系及产生单克隆抗体。

染色体工程：新品种培育，单倍体和多倍体胚胎工程：优良品种的快速繁殖和胚胎保存，试管婴儿细胞遗传工程：克隆和转基因技术，稀有动物资源保护。

1.2.4细胞工程应用优质植物快速培育与繁殖；动物胚胎工程快速繁殖优良濒危品种；利用动植物细胞培养生产活性产品药品；新型动植物品质培育；医学器官修复或移植的组织工程；骨骼、软骨、血管、皮肤。

肝脏、胰脏、心脏乳房手指耳朵等转基因动植物的生物反应器工程；转抗胰蛋白酶基因山羊珍稀动植物资源的保存保护；克隆羊多莉、我国克隆牛康康。

遗传学发育学领域的理论研究能源环保领域应用1.2.5细胞工程与其他工程关系图1－3第3章植物组织与细胞培养3.1植物组织培养与细胞培养的区别3.2发展历史3.3植物组织与器官培养3.4植物细胞培养3.5植物原生质体培养本章小结03植物组织与细胞培养3.1植物组织与细胞培养的区别组织培养:从机体内取出组织或细胞,模拟机体内生理条件,在体外进行培养,是指生存或生长成组织.细胞培养:动植物细胞在体外条件下的存活或生长,此时细胞不再形成组织.3.2发展历史施旺施来登-细胞学说1902年哈珀兰德尝试组织培养-植物组培之父1934年怀特提出植物细胞具有全能性1937年高特里特胡萝卜根组织1948斯科克提出腺嘌呤/生长素比例是控制芽根形成的条件1953年谬尔建立单细胞无性繁殖1956年米勒发现激动素,并提出激动素/生长素控制器官分化1958年施图尔德从胡萝卜根韧皮部愈伤组织得到完整植株,证实植物具全能性.1960年莫雷尔用兰属茎尖培养实现去病毒和快速繁殖我国罗宗洛从事离体根尖培养,李继侗发现银杏胚乳提取物对离体胚发育作用.我国研究无性系的快速繁殖,如甘蔗草莓葡萄菠萝等3.3植物组织与器官培养3.3.1定义:在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给与适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽或者长成新的完整植株的一种实验技术。

也称试管植物。

3.3.2重要概念全能细胞：能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育为一个完全相同的生物体。

愈伤组织：外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。

外植体：植物组培中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等。

继代培养：将培养一段时间的愈伤组织转移到新的培养基上的过程。

3.3.3细胞分化和形态建成培养的植物细胞或组织脱分化，形成愈伤组织新形成的愈伤组织形成一些分生细胞团，分化产生不同器官原基。

3.3.4植物组织培养步骤 P34 图3－13.3.4.1培养材料的采集：全能细胞包括：1）受精卵；2）分生组织；3）雌雄配子及单倍体细胞。

采集茎尖分生组织3.3.4.2培养材料消毒1）材料自来水冲洗，无菌纱布吸干，消毒刀片切成小块2）70％酒精浸泡30－60sec3）漂白粉或0.01％升汞（HgCl2）中10min4）去除后无菌水冲洗。

3.3.4.3制备外植体0.2－0.5cm3.3.4.4接种和培养接种－封口－温度 25℃－增殖3.3.4.5根的诱导3.3.4.6组培苗的炼苗移栽室温自然光照3天3.3.5愈伤组织培养3.3.5.1愈伤组织培养的基本过程1）愈伤组织形成：启动期；分裂期；分化期2）愈伤组织生长3）愈伤组织的分化和形态发生，受自身条件和培养条件影响3.3.5.2应用举例1）芦荟组织快繁。

P372）海带愈伤组织培养。

P38；图3－2，3－33.3.6植物器官培养定义：将植物植株上的各种器官从母体上分离出来，放在无菌的人工环境中让其进一步发育，最终长成幼苗的过程。

包括：毛状根，芽，体细胞胚等3.3.7植物组培的应用3.3.7.1无性系快繁技术周期短，繁殖系数高，不受季节限制，便于工厂化生产3.3.7.2获得无病毒植株无性系不能脱毒，影响花卉观赏效果，作物产量植物生长点附近无病毒。

3.3.7.3新品种选育 P42结合细胞融合、基因转移育种1）突变育种2）原生质体融合与细胞杂交3）花药花粉培养与单倍体植株3.3.7.4在遗传、生理生化和病理研究中的应用植物营养、光合作用、抗病性、染色体变异3.3.7.5种质资源保存3.3.7.6产业化生产前景1）花卉种苗产业化生产2）蔬菜水果种苗脱毒3）瓜果组培产业化生产3.3.8人工种子 P45定义：最外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体优势：便于运输储藏；胚乳成分可控制；固定杂种优势；作为植物基因工程的桥梁；保存珍贵品种包埋介质：对胚乳无伤害；柔软性；硬度；穿透性；便于播种包埋方法：复合凝聚；界面聚合；离子交换凝胶；变温凝胶3.3.9植物组织与器官的生物反应器培养自学3.3.10植物组培存在问题 P501）研究中问题培养教困难的缺乏研究2）技术问题效率低、操作繁琐、结果不确定。

如培养基配方，小植株变异，品种退化3）可应用范围很多未离体培养，如果树花药，珍贵濒危植物等4）生物反应器技术3.4植物细胞培养3.4.1定义：在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡排样，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的技术。

3.4.2植物细胞培养方法 P52单倍体培养：原生质体培养：培养系统：固体培养：琼脂，固定化培养－包埋在海藻酸盐或卡拉胶中。

液体培养：静止培养－原生质体；振荡培养；悬浮培养3.4.3植物细胞培养的培养基3.4.3.1组成1）无机盐：硝酸盐，钾，磷镁钙硫2）碳源；蔗糖或葡萄糖3）植物生长激素：生长素－吲哚乙酸（IAA）、2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）。

分裂素－6－苄基嘌呤（6BA）、玉米素4）有机氮源：蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基酸混合物。

5）有机酸：丙酮酸、柠檬酸的三羧酸中间产物6）复合物质：酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁3.4.3.2培养基准备试剂用高纯度，激素需重结晶，后用酒精溶解，琼脂0.6－1.0％，120℃，15－20min，热敏性过滤灭菌，配成10倍或100倍母液，CaCl2，KI，EDTA分开配置，避免沉淀。

3.4.4植物单细胞培养3.4.4.1单细胞制备方法机械法；酶解法；愈伤组织诱导法3.4.4.2单细胞培养方法1）平板培养法2）看护培养与饲养层培养法看护培养：将单个细胞接种于滤纸上，置于愈伤组织上培养饲养层培养：用处理过的无活性的或分裂很慢、不具备分裂能力的细胞饲养所需培养的细胞。

3）液体浅层经置培养法4）细胞悬浮培养法3.4.4.3悬浮细胞培养的同步化方法 P56一、物理方法1）体积选择法：不同孔径筛网过滤2）冷处理法：4℃处理数天二、化学法1）饥饿法：2）抑制法：添加尿苷，5‘脱氧尿苷3）有丝分裂抑制法：秋水仙素3.4.4.4细胞的保存一、继代培养保存，1－2周换液二、低温保存，5－10℃，10天换液三、冷冻保存：低温保存，－20℃，1－2年；超低温保存，液氮3.4.5植物细胞培养的意义与应用举例植物细胞含有人类所需的成分植物细胞也可以在发酵罐中大量培养利用植物细胞生产次生代谢产物细胞培养技术优点：1）代谢产物的生产在控制条件下，选择优良的细胞系和培养方法，得到超越植株的产量2）无菌条件，排除病菌和害虫3）特定生物转化途径，获得均一的有效成分4）探索新的合成路线，获得新的有用物质一、药用代谢产物P57药用成分：苷类：皂苷（人参皂苷，三七皂苷，柴胡皂苷，等）强心苷（强心苷醇，毛地黄苷，等）甘草皂苷，香豆经苷甾醇：菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇，胆甾醇，异岩甾醇生物碱：吡啶，喹啉，异喹啉醌类：蒽醌，萘醌，返醌蛋白类：胰岛素，氨基酸，蛋白抑制剂，植物病毒抑制剂，植物抗生素等，苦瓜植物中的植物胰岛素，换概念，没有这个称呼。